Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Toxoplasma gondii ni vimelea vya protozoa ndani ya seli ambayo hurekebisha mazingira madogo ya mwenyeji aliyeambukizwa na inajulikana kuhusishwa na matukio ya ukuaji wa uvimbe wa ubongo.Katika utafiti huu, tunakisia kwamba exosomal miRNA-21 kutoka kwa maambukizi ya Toxoplasma inakuza ukuaji wa uvimbe wa ubongo.Exosomes kutoka kwa microglia ya BV2 iliyoambukizwa na Toxoplasma ilibainishwa na kuingizwa ndani kwa seli za glioma za U87 kulithibitishwa.Profaili za usemi wa exosomal microRNA zilichanganuliwa kwa kutumia safu za microRNA na microRNA-21A-5p zinazohusiana na Toxoplasma gondii na upangaji uvimbe.Pia tulichunguza viwango vya mRNA vya jeni zinazohusiana na uvimbe katika seli za glioma za U87 kwa kubadilisha viwango vya miR-21 katika exosomes na athari za exosomes kwenye kuenea kwa seli za glioma za U87.Katika exosomes ya seli za glioma za U87 zilizoambukizwa na Toxoplasma gondii, usemi wa microRNA-21 huongezeka na shughuli za jeni za antitumor (FoxO1, PTEN, na PDCD4) hupunguzwa.Exosomes zinazotokana na BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma huchochea kuenea kwa seli za glioma za U87.Exosomes huchochea ukuaji wa seli za U87 katika muundo wa uvimbe wa panya.Tunapendekeza kwamba ongezeko la miR-21 ya exosomal katika mikroglia ya BV2 iliyoambukizwa Toxoplasma inaweza kuwa na jukumu muhimu kama kikuza ukuaji wa seli katika seli za glioma za U87 kwa kupunguza jeni za antitumor.
Inakadiriwa kuwa zaidi ya visa milioni 18.1 vya saratani ya hali ya juu viligunduliwa ulimwenguni kote mnamo 2018, na takriban 297,000 za mfumo mkuu wa neva ziligunduliwa kila mwaka (1.6% ya tumors zote)1.Utafiti wa awali umeonyesha kuwa mambo ya hatari ya kukuza uvimbe wa ubongo wa binadamu ni pamoja na bidhaa mbalimbali za kemikali, historia ya familia, na mionzi ya ionizing kutoka kwa vifaa vya matibabu na uchunguzi wa kichwa.Hata hivyo, sababu halisi ya ugonjwa huu mbaya haijulikani.Takriban 20% ya saratani zote duniani husababishwa na mawakala wa kuambukiza, ikiwa ni pamoja na virusi, bakteria na vimelea3,4.Viini vya magonjwa ya kuambukiza huvuruga mifumo ya kijenetiki ya seli mwenyeji, kama vile kutengeneza DNA na mzunguko wa seli, na inaweza kusababisha kuvimba kwa muda mrefu na uharibifu wa mfumo wa kinga5.
Wakala wa kuambukiza wanaohusishwa na saratani ya binadamu ni magonjwa ya kawaida ya virusi, ikiwa ni pamoja na virusi vya papilloma ya binadamu na virusi vya hepatitis B na C.Vimelea pia vinaweza kuchukua jukumu linalowezekana katika ukuzaji wa saratani ya binadamu.Aina kadhaa za vimelea, ambazo ni Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis na Hymenolepis nana, zimehusishwa katika aina mbalimbali za saratani ya binadamu 6,7,8.
Toxoplasma gondii ni protozoani ya ndani ya seli ambayo inadhibiti mazingira madogo ya seli jeshi zilizoambukizwa.Kimelea hiki kinakadiriwa kuambukiza takriban 30% ya idadi ya watu duniani, na kuweka idadi ya watu wote katika hatari9,10.Toxoplasma gondii inaweza kuambukiza viungo muhimu, ikiwa ni pamoja na mfumo mkuu wa neva (CNS), na kusababisha magonjwa hatari kama vile homa ya uti wa mgongo na encephalitis, hasa kwa wagonjwa walio na kinga9.Hata hivyo, Toxoplasma gondii inaweza pia kubadilisha mazingira ya mwenyeji aliyeambukizwa kwa kurekebisha ukuaji wa seli na majibu ya kinga kwa watu wasio na uwezo wa kinga, na kusababisha udumishaji wa maambukizi ya muda mrefu yasiyo ya dalili9,11.Jambo la kufurahisha, kutokana na uwiano kati ya kuenea kwa T. gondii na matukio ya uvimbe wa ubongo, baadhi ya ripoti zinaonyesha kuwa katika vivo mwenyeji mabadiliko ya mazingira kutokana na maambukizi ya muda mrefu ya T. gondii yanafanana na microenvironment ya uvimbe.
Exosomes hujulikana kama mawasiliano baina ya seli ambazo hutoa maudhui ya kibiolojia, ikiwa ni pamoja na protini na asidi nucleic, kutoka kwa seli za jirani16,17.Exosomes inaweza kuathiri michakato ya kibayolojia inayohusiana na uvimbe kama vile anti-apoptosis, angiogenesis, na metastasis katika mazingira madogo ya uvimbe.Hasa, miRNAs (miRNAs), RNA ndogo zisizo na msimbo kuhusu urefu wa nyukleotidi 22, ni vidhibiti muhimu vya jeni vya baada ya unukuzi ambavyo vinadhibiti zaidi ya 30% ya mRNA ya binadamu kupitia tata ya kunyamazisha inayotokana na miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii inaweza kutatiza michakato ya kibayolojia kwa kudhibiti mwonekano wa miRNA katika mwenyeji walioambukizwa.MiRNA mwenyeji ina ishara muhimu za kudhibiti michakato ya kibaolojia ya mwenyeji ili kufikia mkakati wa kuishi wa vimelea.Kwa hivyo, kusoma mabadiliko katika wasifu wa mwenyeji wa miRNA baada ya kuambukizwa na T. gondii kunaweza kutusaidia kuelewa mwingiliano kati ya mwenyeji na T. gondii kwa uwazi zaidi.Hakika, Thirugnanam et al.15 ilipendekeza kuwa T. gondii inakuza saratani ya ubongo kwa kubadilisha usemi wake kwenye miRNA mwenyeji maalum inayohusishwa na ukuaji wa uvimbe na ikagundua kuwa T. gondii inaweza kusababisha gliomas katika wanyama wa majaribio.
Utafiti huu unazingatia mabadiliko ya exosomal miR-21 katika mikroglia mwenyeji iliyoambukizwa na Toxoplasma BV2.Tuliona jukumu linalowezekana la kubadilishwa kwa exosomal miR-21 katika ukuaji wa seli za glioma za U87 kutokana na kubakia kwenye kiini cha FoxO1/p27, ambayo ndiyo shabaha ya miR-21 iliyoonyeshwa kupita kiasi.
Exosomes inayotokana na BV2 ilipatikana kwa kutumia centrifugation tofauti na kuthibitishwa na mbinu mbalimbali ili kuzuia uchafuzi na vipengele vya seli au vesicles nyingine.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ilionyesha mwelekeo tofauti kati ya protini zilizotolewa kutoka kwa seli za BV2 na exosomes (Kielelezo 1A), na sampuli zilitathminiwa kwa uwepo wa Alix, ambayo ilichambuliwa na uzuiaji wa Magharibi wa alama za protini za exosomal katika .Uwekaji alama wa Alix ulipatikana katika protini exosome lakini si katika BV2 kiini lysate protini (Mtini. 1B).Kwa kuongeza, RNA iliyosafishwa kutoka kwa exosomes inayotokana na BV2 ilichambuliwa kwa kutumia bioanalyzer.18S na 28S subunits ribosomal walikuwa mara chache kuzingatiwa katika exosomal RNA uhamiaji muundo, kuonyesha usafi wa kuaminika (Kielelezo 1C).Hatimaye, hadubini ya elektroni ya maambukizi ilionyesha kwamba exosomes aliona walikuwa kuhusu 60-150 nm katika kawaida na alikuwa na muundo kikombe-kama mfano wa morphology exosome (Mtini. 1D).
Tabia ya exosomes inayotokana na seli za BV2.(A) Ukurasa wa karatasi ya data ya usalama.Protini zilitengwa kutoka kwa seli za BV2 au exosomes inayotokana na BV2.Mifumo ya protini hutofautiana kati ya seli na exosomes.(B) Uchambuzi wa doa wa Magharibi wa alama ya exosomal (Alix).(C) Tathmini ya RNA iliyosafishwa kutoka kwa seli za BV2 na exosomes zinazotokana na BV2 kwa kutumia bioanalyzer.Kwa hivyo, subunits za 18S na 28S za ribosomal katika seli za BV2 hazikupatikana katika RNA exosomal.(D) Hadubini ya elektroni ya uhamishaji ilionyesha kuwa exosomes zilizotengwa na seli za BV2 zilikuwa na madoa hasi na 2% ya acetate ya uranyl.Exosomes ni takriban nm 60-150 kwa ukubwa na umbo la kikombe (Wimbo na Jung, data ambayo haijachapishwa).
Uingizaji wa ndani wa seli za exosomes zinazotokana na BV2 katika seli za glioma za binadamu za U87 ulionekana kwa kutumia hadubini ya confocal.Exosomes zilizo na lebo za PKH26 zimewekwa ndani ya saitoplazimu ya seli za U87.Nuclei zilitiwa doa na DAPI (Mchoro 2A), ikionyesha kwamba exosomes zinazotokana na BV2 zinaweza kuingizwa ndani na seli mwenyeji na kuathiri mazingira ya seli za wapokeaji.
Uingizaji wa exosomes zinazotokana na BV2 ndani ya seli za glioma za U87 na exosomes zinazotokana na BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma RH zilisababisha kuenea kwa seli za glioma za U87.(A) Exosomes zilizomezwa na seli za U87 zilizopimwa kwa hadubini ya confocal.Seli za glioma za U87 ziliwekwa ndani na exosomes zilizoandikwa PKH26 (nyekundu) au bila udhibiti kwa saa 24.Viini vilitiwa rangi na DAPI (bluu) na kisha kuzingatiwa chini ya darubini ya confocal (bar ya mizani: 10 μm, x 3000).(B) Uenezi wa seli za glioma za U87 ulibainishwa na majaribio ya kuenea kwa seli.Seli za glioma za U87 zilitibiwa kwa exosomes kwa muda uliowekwa. *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 na Jaribio la t la Mwanafunzi. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi.
Baada ya kuthibitisha kuingizwa ndani kwa exosomes zinazotokana na BV2 katika seli za glioma za U87, tulifanya majaribio ya uenezaji wa seli ili kuchunguza dhima ya exosomes inayotokana na BV2 inayotokana na Toxoplasma katika ukuzaji wa seli za glioma za binadamu.Matibabu ya seli za U87 zilizo na exosomes kutoka kwa seli za BV2 zilizoambukizwa na T. gondii zilionyesha kuwa exosomes inayotokana na T. gondii iliyotokana na BV2 ilisababisha kuenea kwa kiasi kikubwa kwa seli za U87 ikilinganishwa na udhibiti (Mchoro 2 B).
Kwa kuongezea, ukuaji wa seli za U118 ulikuwa na matokeo sawa na U87, kwani Toxoplasma ilichochea exosomes ilisababisha viwango vya juu zaidi vya kuenea (data haijaonyeshwa).Kulingana na data hizi, tunaweza kuonyesha kwamba exosomes zilizoambukizwa na Toxoplasma zinazotokana na BV2 zina jukumu muhimu katika kuenea kwa seli za glioma.
Ili kuchunguza athari za exosomes zinazotokana na BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma kwenye ukuzaji wa uvimbe, tuliingiza seli za glioma za U87 kwenye panya uchi kwa mfano wa xenograft na kuingiza exosomes zinazotokana na BV2 au exosomes zinazotokana na RH zilizoambukizwa na BV2.Baada ya uvimbe kuonekana baada ya wiki 1, kila kundi la majaribio la panya 5 liligawanywa kulingana na ukubwa wa uvimbe ili kubaini mahali sawa pa kuanzia, na ukubwa wa uvimbe ulipimwa kwa siku 22.
Katika panya na mfano wa xenograft wa U87, ukubwa mkubwa wa tumor na uzito ulizingatiwa katika kikundi cha exosome kilichoambukizwa na RH kilichotokana na BV2 siku ya 22 (Mchoro 3A, B).Kwa upande mwingine, hakukuwa na tofauti kubwa katika saizi ya uvimbe kati ya kikundi cha exosome kinachotokana na BV2 na kikundi cha kudhibiti baada ya matibabu ya nje.Aidha, panya hudungwa na seli glioma na exosomes kuibua kuonyeshwa ukubwa tumor kiasi katika kundi la RH-kuambukizwa BV2-derived exosomes (Mtini. 3C).Matokeo haya yanaonyesha kuwa exosomes zinazotokana na BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma huchochea ukuaji wa glioma katika muundo wa uvimbe wa panya.
Oncogenesis (AC) ya exosomes zinazotokana na BV2 katika modeli ya panya ya U87 ya xenograft.Ukubwa wa uvimbe (A) na uzito (B) uliongezwa kwa kiasi kikubwa katika panya uchi wa BALB/c waliotibiwa na exosomes zilizoambukizwa na RH zinazotokana na BV2.BALB/c panya uchi (C) walidungwa chini ya ngozi na seli 1 x 107 za U87 zikiwa zimesimamishwa kwenye mchanganyiko wa Matrigel.Siku sita baada ya sindano, 100 μg ya exosomes inayotokana na BV2 ilitibiwa kwenye panya.Ukubwa na uzito wa tumor ulipimwa kwa siku zilizoonyeshwa na baada ya dhabihu, kwa mtiririko huo. *P <0.05. *P <0.05. *Р <0,05. *P <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р <0,05. *P <0.05.
data ilionyesha kuwa 37 miRNAs (16 overexpressed na 21 downexpressed) kuhusishwa na kinga au maendeleo tumor walikuwa kwa kiasi kikubwa ilibadilika katika microglia baada ya kuambukizwa na Strain Toxoplasma RH (Mtini. 4A).Viwango vya kujieleza vya miR-21 kati ya miRNA iliyobadilishwa vilithibitishwa na RT-PCR ya wakati halisi katika exosomes inayotokana na BV2, exosomes kutibiwa na BV2 na seli za U87.Usemi wa miR-21 ulionyesha ongezeko kubwa la exosomes kutoka kwa seli za BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma gondii (shida ya RH) (Mchoro 4 B).Viwango vya kujieleza vya miR-21 katika seli za BV2 na U87 viliongezeka baada ya kuchukua exosomes zilizobadilishwa (Mchoro 4 B).viwango vya jamaa ya miR-21 kujieleza katika tishu za ubongo wa wagonjwa tumor na panya kuambukizwa na Toxoplasma gondii (ME49 Strain) walikuwa juu kuliko katika udhibiti, kwa mtiririko huo (Mtini. 4 C).Matokeo haya yanahusiana na tofauti kati ya viwango vya kujieleza vya microRNA zilizotabiriwa na zilizothibitishwa katika vitro na vivo.
Mabadiliko katika usemi wa exosomal miP-21a-5p katika microglia iliyoambukizwa na Toxoplasma gondii (RH).(A) Huonyesha mabadiliko makubwa katika siRNA yanayohusiana na kinga au ukuaji wa uvimbe kufuatia maambukizi ya T. gondii RH.(B) Viwango vya kujieleza vya miR-21 viligunduliwa na RT-PCR ya wakati halisi katika exosomes zinazotokana na BV2, exosomes zilizotibiwa na BV2, na seli za U87.(C) Viwango vya kujieleza vya miR-21 vilipatikana katika tishu za ubongo za wagonjwa wa tumor (N=3) na panya walioambukizwa na Toxoplasma gondii (shida ya ME49) (N=3). *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 ilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi.
Exosomes kutoka kwa seli za BV2 zilizoambukizwa na RH zilisababisha ukuaji wa gliomas katika vivo na katika vitro (Mchoro 2, 3).Ili kugundua mRNA zinazofaa, tulichunguza viwango vya mRNA vya jeni lengwa la antitumor, kisanduku cha uma O1 (FoxO1), PTEN, na kifo cha seli 4 (PDCD4) kilichopangwa katika seli za U87 zilizoambukizwa na exosomes inayotokana na BV2 au RH BV2.Uchunguzi wa bioinformatics umeonyesha kuwa jeni kadhaa zinazohusiana na tumor, ikiwa ni pamoja na FoxO1, PTEN, na PDCD4 jeni, zina tovuti za kufunga za miR-2121,22.viwango vya mRNA ya jeni lengo antitumor walikuwa kupunguzwa katika RH-kuambukizwa BV2-inayotokana exosomes ikilinganishwa na exosomes BV2-derived (Mtini. 5A).FoxO1 ilionyesha viwango vya protini vilivyopunguzwa katika exosomes zinazotokana na RH zilizoambukizwa na BV2 ikilinganishwa na exosomes zinazotokana na BV2 (Mchoro 5B).Kulingana na matokeo haya, tunaweza kuthibitisha kwamba exosomes inayotokana na BV2 iliyoambukizwa na RH hupunguza jeni za kupambana na oncogenic, kudumisha jukumu lao katika ukuaji wa tumor.
Exosomes zinazotokana na BV2 zilizoambukizwa na Toxoplasma RH huchochea ukandamizaji wa jeni za antitumor katika seli za glioma za U87 na exosomes inayotokana na Toxoplasma RH iliyoambukizwa na BV2.(A) PCR ya wakati halisi ya FoxO1, PTEN na usemi wa PDCD4 katika exosomes inayotokana na T. gondii RH-iliyoambukizwa BV2 ikilinganishwa na exosomes ya PBS.β-actin mRNA ilitumika kama kidhibiti.(B) Usemi wa FoxO1 ulibainishwa na ukaushaji wa Magharibi na data ya densitometry ilitathminiwa kitakwimu kwa kutumia programu ya ImageJ. *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P <0.05 ilipatikana kwa mtihani wa Mwanafunzi. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 ilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ilipatikana kwa kutumia mtihani wa t wa Mwanafunzi.
Ili kuelewa athari za miP-21 katika exosomes kwenye udhibiti wa jeni zinazohusiana na tumor, seli za U87 zilipitishwa kwa kizuizi cha miP-21 kwa kutumia Lipofectamine 2000 na seli zilivunwa saa 24 baada ya kuambukizwa.Viwango vya kujieleza vya FoxO1 na p27 katika seli zilizopitishwa kwa vizuizi vya miR-21 vililinganishwa na seli zilizotibiwa na exosomes zinazotokana na BV2 kwa kutumia qRT-PCR (Mchoro 6A, B).Uhamisho wa kizuizi cha miR-21 kwenye seli za U87 ulipunguza sana udhibiti wa FoxO1 na usemi wa p27 (FIG. 6).
Exosomal BV2-inayotokana na miP-21 iliyoathiriwa na RH ilibadilisha usemi wa FoxO1/p27 katika seli za glioma za U87.Seli za U87 zilipitishwa kwa kizuizi cha miP-21 kwa kutumia Lipofectamine 2000 na seli zilivunwa saa 24 baada ya kuambukizwa.Viwango vya kujieleza vya FoxO1 na p27 katika seli zilizopitishwa kwa vizuizi vya miR-21 vililinganishwa na viwango vya seli zilizotibiwa na exosomes zinazotokana na BV2 kwa kutumia qRT-PCR (A, B).
Ili kuepuka mwitikio wa kinga ya mwenyeji, vimelea vya Toxoplasma hubadilika kuwa uvimbe wa tishu.Huharibu tishu mbalimbali, ikiwa ni pamoja na ubongo, moyo, na misuli ya mifupa, katika maisha yote ya mwenyeji na kurekebisha mwitikio wa kinga ya mwenyeji.Kwa kuongeza, wanaweza kudhibiti mzunguko wa seli na apoptosis ya seli za jeshi, na kukuza uenezi wao14,24.Toxoplasma gondii mara nyingi huambukiza seli za dendritic, neutrofili, na ukoo wa monocyte/macrophage, ikijumuisha mikroglia ya ubongo.Toxoplasma gondii inaleta tofauti ya macrophages ya phenotype ya M2, huathiri uponyaji wa jeraha baada ya maambukizi ya pathogen, na pia inahusishwa na hypervascularization na granulomatous fibrosis.Ugonjwa huu wa tabia wa maambukizi ya Toxoplasma unaweza kuhusishwa na alama zinazohusiana na maendeleo ya tumor.Mazingira ya uhasama yanayodhibitiwa na Toxoplasma yanaweza kufanana na saratani inayolingana.Kwa hiyo, inaweza kuzingatiwa kuwa maambukizi ya Toxoplasma yanapaswa kuchangia maendeleo ya tumors za ubongo.Kwa kweli, viwango vya juu vya maambukizi ya Toxoplasma vimeripotiwa katika seramu ya wagonjwa wenye tumors mbalimbali za ubongo.Kwa kuongeza, Toxoplasma gondii inaweza kuwa athari nyingine ya kasinojeni na kutenda kwa ushirikiano ili kusaidia kansa nyingine zinazoambukiza kuendeleza uvimbe wa ubongo.Katika suala hili, ni muhimu kuzingatia kwamba virusi vya P. falciparum na Epstein-Barr huchangia kwa pamoja katika malezi ya lymphoma ya Burkitt.
Jukumu la exosomes kama vidhibiti katika uwanja wa utafiti wa saratani limechunguzwa sana.Hata hivyo, jukumu la exosomes kati ya vimelea na wenyeji walioambukizwa bado halijaeleweka vizuri.Hadi sasa, wasimamizi mbalimbali, ikiwa ni pamoja na protini zilizofichwa, wameelezea michakato ya kibiolojia ambayo vimelea vya protozoan hupinga mashambulizi ya mwenyeji na kuendeleza maambukizi.Hivi majuzi, kumekuwa na dhana inayokua kwamba vijiumbe vidogo vinavyohusishwa na protozoa na viini vidogo vidogo vyake vya RNA huingiliana na seli mwenyeji ili kuunda mazingira yanayofaa kwa maisha yao.Kwa hivyo, tafiti zaidi zinahitajika ili kugundua uhusiano kati ya miRNA ya exosomal iliyobadilishwa na kuenea kwa seli za glioma.Ubadilishaji wa MicroRNA (jeni za nguzo miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 na miR-17-92) hufungamana na kikuzaji STAT3 katika makrofaji ya binadamu yaliyoambukizwa na toxoplasma, hudhibitiwa na huchochea kinga. -apoptosis katika kukabiliana na maambukizi ya Toxoplasma gondii 29.Maambukizi ya Toxoplasma huongeza maneno ya miR-17-5p na miR-106b-5p, ambayo yanahusishwa na magonjwa kadhaa ya hyperproliferative 30.Data hizi zinaonyesha kuwa miRNAs mwenyeji zinazodhibitiwa na maambukizi ya Toxoplasma ni molekuli muhimu kwa maisha ya vimelea na pathogenesis katika tabia ya kibaolojia ya mwenyeji.
MiRNA iliyobadilishwa inaweza kuathiri aina mbalimbali za tabia wakati wa kuanzishwa na kuendelea kwa seli mbaya, ikiwa ni pamoja na gliomas: kujitosheleza kwa ishara za ukuaji, kutokuwa na hisia kwa ishara za kuzuia ukuaji, kuepuka apoptosis, uwezo wa kujirudia usio na kikomo, angiojenesisi, uvamizi na metastasis, na kuvimba.Katika glioma, miRNA iliyobadilishwa imetambuliwa katika tafiti nyingi za maelezo mafupi.
Katika utafiti huu, tulithibitisha viwango vya juu vya kujieleza kwa miRNA-21 katika seli za jeshi zilizoambukizwa na toxoplasma.miR-21 imetambuliwa kama mojawapo ya microRNA zinazoonyeshwa mara nyingi zaidi katika uvimbe mnene, ikiwa ni pamoja na gliomas, 33 na usemi wake unahusiana na daraja la glioma.Ushahidi unaokusanywa unaonyesha kwamba miR-21 ni riwaya ya onkojeni ambayo hufanya kazi kama kipengele cha kuzuia apoptotic katika ukuaji wa glioma na inaonyeshwa sana katika tishu na plasma ya uharibifu wa ubongo wa binadamu.Inashangaza, uzima wa miR-21 katika seli na tishu za glioma husababisha kizuizi cha kuenea kwa seli kutokana na apoptosis inayotegemea caspase.Uchanganuzi wa kibiolojia wa malengo yaliyotabiriwa ya miR-21 ulifunua jeni nyingi za kukandamiza uvimbe zinazohusiana na njia za apoptosis, ikijumuisha kifo cha seli 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, na kisanduku cha O1 (FoxO1), kilicho na tovuti inayofunga miR-2121..22.38.
FoxO1, kama mojawapo ya sababu za unukuzi (FoxO), inahusika katika ukuzaji wa aina mbalimbali za saratani ya binadamu na inaweza kudhibiti usemi wa jeni za kukandamiza uvimbe kama vile p21, p27, Bim, na FasL40.FoxO1 inaweza kufunga na kuwezesha vizuizi vya mzunguko wa seli kama vile p27 ili kukandamiza ukuaji wa seli.Zaidi ya hayo, FoxO1 ni athari kuu ya uwekaji saini wa PI3K/Akt na inadhibiti michakato mingi ya kibaolojia kama vile kuendelea kwa mzunguko wa seli na utofautishaji wa seli kupitia kuwezesha unukuzi wa p2742.
Kwa kumalizia, tunaamini kwamba exosomal miR-21 inayotokana na microglia iliyoambukizwa na Toxoplasma inaweza kuwa na jukumu muhimu kama mdhibiti wa ukuaji wa seli za glioma (Mchoro 7).Hata hivyo, tafiti zaidi zinahitajika ili kupata kiungo cha moja kwa moja kati ya exosomal miR-21, maambukizi ya Toxoplasma yaliyobadilishwa, na ukuaji wa glioma.Matokeo haya yanatarajiwa kutoa kianzio cha kusoma uhusiano kati ya maambukizi ya Toxoplasma na matukio ya glioma.
Mchoro wa mpangilio wa utaratibu wa kansajeni ya glioma (ubongo) unapendekezwa katika utafiti huu.Mwandishi huchora katika PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Itifaki zote za majaribio katika utafiti huu, ikiwa ni pamoja na matumizi ya wanyama, zililingana na Miongozo ya Kimaadili ya Chuo Kikuu cha Kitaifa cha Seoul cha Huduma ya Wanyama na Kamati ya Watumiaji na ziliidhinishwa na Bodi ya Ukaguzi ya Kitaasisi ya Shule ya Tiba ya Chuo Kikuu cha Kitaifa cha Seoul (nambari ya IRB SNU- 150715).-2).Taratibu zote za majaribio zilifanyika kwa mujibu wa mapendekezo ya ARRIVE.
BV2 mouse microglia na U87 human glioma seli zilikuzwa katika Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) na Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), mtawalia, kila moja ikiwa na 10% ya seramu ya ng'ombe wa fetasi, 4 mM l- glutamine, penicillin 0.2 mM na 0.05 mm streptomycin.Seli zilikuzwa katika incubator yenye 5% CO2 ifikapo 37°C.Laini nyingine ya seli ya glioma, U118, ilitumika kwa kulinganisha na seli za U87.
Ili kutenganisha exosomes kutoka kwa aina ya RH na ME49 iliyoambukizwa na T. gondii, T. gondii tachyzoites (shida ya RH) ilivunwa kutoka kwenye cavity ya tumbo ya panya wa umri wa wiki 6 wa BALB/c hudungwa siku 3-4 kabla.Tachyzoites zilioshwa mara tatu na PBS na kusafishwa kwa centrifugation katika 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Ili kupata tachyzoites ya matatizo ME49, BALB/c panya walikuwa intraperitoneally sindano na cysts 20 tishu na mabadiliko tachyzoite katika cysts zilikusanywa kwa kuosha cavity ya tumbo siku 6-8 baada ya kuambukizwa (PI).Panya walioambukizwa na PBS.Tachyzoiti za ME49 zilikuzwa katika seli zilizoongezwa 100 μg/ml penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL), na 5% ya seramu ya bovine ya fetasi (Lonza, Walkersville, MD) .., Marekani) kwa 37 °C na 5% dioksidi kaboni.Baada ya kukuzwa katika seli za Vero, tachyzoiti za ME49 zilipitishwa mara mbili kupitia sindano ya geji 25 na kisha kupitia chujio cha 5 µm ili kuondoa uchafu na seli.Baada ya kuosha, tachyzoites zilisimamishwa tena katika PBS44.Vivimbe vya tishu za aina ya Toxoplasma gondii ME49 vilidumishwa kwa kudungwa kwa sindano ya ndani ya vivimbe vilivyotengwa na ubongo wa panya C57BL/6 walioambukizwa (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Akili za panya walioambukizwa ME49 zilivunwa baada ya miezi 3 ya PI na kusagwa chini ya darubini ili kutenga uvimbe.Panya walioambukizwa walihifadhiwa chini ya hali maalum zisizo na pathojeni (SPF) katika Shule ya Tiba ya Chuo Kikuu cha Kitaifa cha Seoul.
Jumla ya RNA ilitolewa kutoka kwa exosomes zinazotokana na BV2, seli za BV2 na tishu kwa kutumia MiRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Ujerumani) kulingana na maagizo ya mtengenezaji, ikiwa ni pamoja na muda wa incubation kwa hatua ya elution.Mkusanyiko wa RNA ulibainishwa kwenye spectrophotometer ya NanoDrop 2000.Ubora wa safu ndogo za RNA ulitathminiwa kwa kutumia bioanalyzer ya Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Uholanzi).
DMEM yenye 10% exosome-poor FBS ilitayarishwa kwa kutumia ultracentrifugation katika 100,000g kwa saa 16 kwa 4°C na kuchujwa kupitia kichujio cha 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Seli za BV2, 5 × 105, zilikuzwa katika DMEM ikiwa na 10% ya FBS isiyo na exosome na 1% ya viuavijasumu katika 37°C na 5% CO2.Baada ya saa 24 za incubation, tachyzoiti za aina ya RH au ME49 (MOI = 10) ziliongezwa kwenye seli na vimelea visivyovamia viliondolewa ndani ya saa moja na kujazwa tena na DMEM.Exosomes kutoka kwa seli za BV2 zilitengwa kwa kurekebishwa kwa utofautishaji, njia inayotumika sana.Sitisha pellet ya exosome katika 300 µl PBS kwa RNA au uchanganuzi wa protini.Mkusanyiko wa exosomes zilizotengwa iliamuliwa kwa kutumia kifaa cha kupima protini cha BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) na NanoDrop 2000 spectrophotometer.
Mvua kutoka kwa seli za BV2 au exosomes zinazotokana na BV2 ziliwekwa kwenye myeyusho wa proteni wa PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) na protini zilipakiwa kwenye Coomassie buluu ya kung'aa iliyotiwa rangi 10% ya jeli za SDS polyacrylamide.Kwa kuongezea, protini zilihamishiwa kwa utando wa PVDF kwa masaa 2.Madoa ya Magharibi yaliidhinishwa kwa kutumia kingamwili ya Alix (Teknolojia ya Kuashiria Seli, Beverly, MA, USA) kama alama ya exosomal.Mbuzi aliyeunganishwa na HRP wa anti-panya IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) na kichanganuzi cha picha cha LAS-1000 pamoja na luminescent (Filamu ya Picha ya Fuji, Tokyo, Japan) zilitumika kama kingamwili ya pili..Microscopy ya elektroni ya upitishaji ilifanywa ili kusoma saizi na mofolojia ya exosomes.Exosomes zilizotengwa kutoka kwa seli za BV2 (6.40 µg/µl) zilitayarishwa kwenye wavu zilizopakwa kaboni na kuchafuliwa kwa 2% ya acetate ya uranyl kwa dakika 1.Sampuli zilizotayarishwa zilizingatiwa kwa kasi ya voltage ya 80 kV kwa kutumia JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) iliyo na kamera ya ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Exosomes zinazotokana na BV2 zilitiwa madoa kwa kutumia PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kwa dakika 15 kwenye joto la kawaida.Seli za U87, 2×105, zenye exosomes zilizo na lebo ya PKH26 (nyekundu) au zisizo na exosomes kama kidhibiti hasi, ziliwekwa ndani ya 37°C kwa saa 24 katika incubator ya CO2 ya 5%.Viini vya seli za U87 vilitiwa doa na DAPI (bluu), seli za U87 ziliwekwa katika paraformaldehyde 4% kwa dakika 15 kwa 4°C na kisha kuchambuliwa katika mfumo wa darubini ya Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Ujerumani).inayoonekana.
cDNA iliundwa kutoka kwa siRNA kwa kutumia mchanganyiko wa safu ya kwanza ya Mir-X siRNA na SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japani).PCR ya muda halisi ilitekelezwa kwa kutumia mfumo wa kutambua wa PCR wa iQ5 wa wakati halisi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) kwa kutumia vianzio na violezo vilivyochanganywa na SYBR Premix.DNA ilikuzwa kwa mizunguko 40 ya denaturation katika 95°C kwa s 15 na annealing saa 60°C kwa 60 s.Data kutoka kwa kila majibu ya PCR ilichanganuliwa kwa kutumia moduli ya uchanganuzi wa data ya programu ya mfumo wa macho wa iQ™5 (Bio-Rad).Mabadiliko yanayohusiana katika usemi wa jeni kati ya jeni lengwa zilizochaguliwa na β-actin/siRNA (na U6) yalikokotolewa kwa kutumia mbinu ya kawaida ya curve.Mlolongo wa utangulizi unaotumika umeonyeshwa kwenye Jedwali 1.
Seli 3 x 104 za glioma za U87 zilipandwa kwenye sahani zenye visima 96 na kuchanganywa na exosomes zilizoambukizwa na Toxoplasma zinazotokana na BV2 (50 μg/mL) au exosomes zisizo za mapigo zinazotokana na BV2 (50 μg/mL) kama udhibiti saa 12, 18 na 36. .Kiwango cha kuenea kwa seli kilibainishwa kwa kutumia Kifaa cha Kuhesabia Seli-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) (Takwimu za Ziada S1-S3) 46 .
Panya wa kike wa umri wa wiki 5 wa BALB/c walio uchi walinunuliwa kutoka Orient Bio (Seongnam-si, Korea Kusini) na kuwekwa mmoja mmoja katika vizimba tasa kwenye joto la kawaida (22±2°C) na unyevunyevu (45±15°C).%) kwenye joto la kawaida (22±2°C) na unyevunyevu (45±15%).Mzunguko wa mwanga wa saa 12 na mzunguko wa giza wa saa 12 ulifanyika chini ya SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Panya waligawanywa nasibu katika vikundi vitatu vya panya 5 kila moja na vikundi vyote vilidungwa chini ya ngozi na ml 400 za PBS zenye seli 1 x 107 U87 za glioma na sababu ya ukuaji ilipunguzwa BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Siku sita baada ya sindano ya uvimbe, 200 mg ya exosomes inayotokana na seli za BV2 (bila/bila maambukizi ya Toxoplasma) zilidungwa kwenye tovuti ya uvimbe.Siku ishirini na mbili baada ya maambukizi ya uvimbe, ukubwa wa uvimbe wa panya katika kila kikundi ulipimwa kwa caliper mara tatu kwa wiki, na kiasi cha tumor kilihesabiwa kwa formula: 0.5 × (upana) × 2 × urefu.
Uchanganuzi wa usemi wa MicroRNA kwa kutumia safu ya miRCURYTM LNA miRNA, kizazi cha 7 kina, safu za mmu na rno (EXIQON, Vedbaek, Denmaki) zinazofunika panya 1119 wenye sifa nzuri kati ya uchunguzi wa kunasa binadamu, panya na panya wa miRNA 3100.Wakati wa utaratibu huu, ng 250 hadi 1000 ya jumla ya RNA iliondolewa kutoka kwa 5′-fosfati kwa kutibiwa na fosfati ya alkali ya matumbo ya ndama ikifuatiwa na kuweka lebo kwa rangi ya kijani ya Hy3 ya fluorescent.Sampuli zilizo na lebo zilichanganywa kwa kupakia slaidi za safu ndogo kwa kutumia vifaa vya chumba cha mseto (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) na vifaa vya slaidi vya mseto (Agilent Technologies).Mchanganyiko ulifanyika kwa saa 16 saa 56 ° C, kisha microarrays ziliosha kwa mujibu wa mapendekezo ya mtengenezaji.Slaidi za safu ndogo zilizochakatwa zilichanganuliwa kwa kutumia mfumo wa kichanganuzi wa safu ndogo ya Agilent G2565CA (Teknolojia za Agilent).Picha zilizochanganuliwa zililetwa kwa kutumia toleo la programu ya Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies) na ukubwa wa fluorescence wa kila picha ulibainishwa kwa kutumia faili inayolingana ya GAL ya itifaki ya Exiqon iliyorekebishwa.Data ya Microarray ya utafiti wa sasa imewekwa katika hifadhidata ya GEO chini ya nambari ya upatanishi GPL32397.
Maelezo mafupi ya miRNA ya exosomal iliyokomaa katika mikroglia ya RH au aina za ME49 zilizoambukizwa na Toxoplasma zilichambuliwa kwa kutumia zana mbalimbali za mtandao.miRNA inayohusishwa na ukuaji wa uvimbe ilitambuliwa kwa kutumia miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) na kuchujwa kwa nguvu ya mawimbi ya kawaida (log2) zaidi ya 8.0.Miongoni mwa miRNAs, miRNAs differentially walionyesha walikuwa kupatikana kuwa zaidi ya 1.5-folded na uchambuzi filter ya miRNAs ilibadilishwa na RH au ME49 Matatizo kuambukizwa na T. gondii.
Seli zilipandwa katika sahani zenye visima sita (seli 3 x 105/kisimani) katika opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) kwa kutumia Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Seli zilizoambukizwa zilikuzwa kwa masaa 6 na kisha kati ilibadilishwa kuwa safi kamili.Seli zilivunwa saa 24 baada ya kuhamishwa.
Uchanganuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia t-test ya Mwanafunzi na programu ya Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Kwa uchanganuzi wa majaribio wa wanyama, ANOVA ya njia mbili ilitekelezwa kwa kutumia programu ya Prism 3.0 (Programu ya GraphPad, La Jolla, CA, USA). Thamani za P chini ya 0.05 zilichukuliwa kuwa muhimu kitakwimu. Thamani za P <0.05 zilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Thamani za P <0.05 zilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义. P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Thamani za P <0.05 zilizingatiwa kuwa muhimu kitakwimu.
Itifaki zote za majaribio zilizotumiwa katika utafiti huu ziliidhinishwa na Bodi ya Mapitio ya Kitaasisi ya Shule ya Tiba ya Chuo Kikuu cha Taifa cha Seoul (nambari ya IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Kadirio la matukio ya saratani duniani na vifo katika 2018: Vyanzo na mbinu za GLOBOCAN.Ufafanuzi.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Maarifa kuhusu hatari za uvimbe wa ubongo na afua zao za matibabu. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Maarifa kuhusu hatari za uvimbe wa ubongo na afua zao za matibabu.Rashid, S., Rehman, K. na Akash, MS Mapitio ya mambo ya hatari kwa tumors za ubongo na hatua kuu za matibabu. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Uelewa wa kina wa sababu za hatari za tumor ya ubongo na uingiliaji wa matibabu.Rashid, S., Rehman, K. na Akash, MS Mapitio ya mambo ya hatari kwa tumors za ubongo na hatua kuu za matibabu.Sayansi ya matibabu.Mfamasia.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Mwingiliano wa bakteria na virusi katika saratani ya njia ya utumbo ya binadamu na njia ya uzazi ya kike: Muhtasari wa ushahidi wa epidemiologic na maabara. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Mwingiliano wa bakteria na virusi katika saratani ya njia ya utumbo ya binadamu na njia ya uzazi ya kike: Muhtasari wa ushahidi wa epidemiologic na maabara.Kato I., Zhang J. na Sun J. Mwingiliano wa bakteria na virusi katika saratani ya njia ya utumbo wa binadamu na njia ya uzazi ya kike: muhtasari wa data ya epidemiological na maabara. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和宓。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virusi mwingiliano katika digestion ya cavity ya mdomo ya binadamu na njia ya uzazi wa kike: muhtasari wa sayansi maarufu ya ugonjwa na ushahidi wa maabara.Kato I., Zhang J. na Sun J. Mwingiliano wa bakteria na virusi katika saratani ya utumbo wa binadamu na saratani ya uke wa kike: muhtasari wa data ya epidemiological na maabara.Saratani 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Kutoka kwa maambukizi hadi saratani: Jinsi virusi vya uvimbe wa DNA hubadilisha kaboni ya kati ya seli na kimetaboliki ya lipid. Magon, KL & Parish, JL Kutoka kwa maambukizi hadi saratani: Jinsi virusi vya uvimbe wa DNA hubadilisha kaboni ya kati ya seli na kimetaboliki ya lipid.Mahon, KL na Parokia, JL Maambukizi ya Moto kwa saratani: jinsi virusi vya tumor kulingana na DNA hubadilisha seli ya seli ya kaboni na kimetaboliki ya lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Kutoka kwa maambukizi hadi saratani: jinsi virusi vya uvimbe wa DNA hubadilisha kaboni ya kati ya seli na kimetaboliki ya lipid.Mahon, KL na Parish, JL Inawasha maambukizo kwa saratani: jinsi virusi vya tumor ya DNA hubadilisha kimetaboliki ya kaboni na lipid katika seli mwenyeji.Fungua Biolojia.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estrojeni za catechol za schistosomes na mafua ya ini na saratani inayohusishwa na helminth.mbele.moto ndani.5, 444 (2014).