Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vidudu vya jeni kwa ajili ya matibabu ya pulmonary cystic fibrosis lazima zielekezwe kwenye njia za hewa za conductive, kwani uhamisho wa mapafu ya pembeni hauna athari ya matibabu.Ufanisi wa maambukizi ya virusi ni moja kwa moja kuhusiana na muda wa makazi ya carrier.Hata hivyo, viowevu vya kujifungua kama vile vibeba jeni kwa kawaida husambaa ndani ya alveoli wakati wa kuvuta pumzi, na chembe za matibabu za umbo lolote huondolewa kwa haraka na usafiri wa mucociliary.Kupanua muda wa makazi ya flygbolag za jeni katika njia ya kupumua ni muhimu lakini ni vigumu kufikia.Chembe za sumaku zilizounganishwa na mtoa huduma zinazoweza kuelekezwa kwenye uso wa njia ya upumuaji zinaweza kuboresha ulengaji wa kikanda.Kwa sababu ya matatizo ya upigaji picha katika vivo, tabia ya chembe ndogo kama hizo za sumaku kwenye uso wa njia ya hewa mbele ya uwanja wa sumaku uliowekwa haieleweki vizuri.Madhumuni ya utafiti huu ilikuwa kutumia taswira ya synchrotron ili kuibua katika vivo mwendo wa mfululizo wa chembe za sumaku kwenye trachea ya panya waliogandishwa ili kujifunza mienendo na mifumo ya tabia ya chembe moja na nyingi katika vivo.Kisha tukatathmini pia ikiwa utoaji wa chembe za sumaku za lentiviral mbele ya uga wa sumaku kungeongeza ufanisi wa upitishaji katika trachea ya panya.Upigaji picha wa X-ray wa Synchrotron huonyesha tabia ya chembe za sumaku katika sehemu zisizosimama na zinazosonga za sumaku katika vitro na vivo.Chembe haziwezi kuvutwa kwa urahisi kwenye uso wa njia za hewa hai kwa kutumia sumaku, lakini wakati wa usafirishaji, amana hujilimbikizia kwenye uwanja wa maoni, ambapo uwanja wa sumaku una nguvu zaidi.Ufanisi wa upitishaji pia uliongezeka mara sita wakati chembe za sumaku za lentiviral zilitolewa mbele ya uwanja wa sumaku.Yakijumlishwa, matokeo haya yanapendekeza kuwa chembechembe za sumaku za lentiviral na sehemu za sumaku zinaweza kuwa mbinu muhimu za kuboresha ulengaji wa vekta ya jeni na viwango vya upitishaji katika njia za hewa zinazopitisha hewa katika vivo.
Cystic fibrosis (CF) husababishwa na kutofautiana kwa jeni moja inayoitwa CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Protini ya CFTR ni chaneli ya ioni ambayo iko katika seli nyingi za epithelial katika mwili wote, ikiwa ni pamoja na njia za hewa, tovuti kuu katika pathogenesis ya cystic fibrosis.Kasoro katika CFTR husababisha usafiri usio wa kawaida wa maji, upungufu wa maji mwilini wa uso wa njia ya hewa, na kupungua kwa safu ya maji ya uso wa njia ya hewa (ASL).Pia hudhoofisha uwezo wa mfumo wa usafiri wa mucociliary (MCT) kusafisha njia za hewa za chembe za kuvuta pumzi na vimelea.Lengo letu ni kutengeneza tiba ya jeni ya lentiviral (LV) ili kutoa nakala sahihi ya jeni la CFTR na kuboresha ASL, MCT, na afya ya mapafu, na kuendelea kutengeneza teknolojia mpya zinazoweza kupima vigezo hivi katika vivo1.
Vekta za LV ni mojawapo ya watahiniwa wakuu wa tiba ya jeni ya cystic fibrosis, hasa kwa sababu wanaweza kuunganisha jeni ya matibabu katika seli za msingi za njia ya hewa (seli shina za njia ya hewa).Hili ni muhimu kwa sababu wanaweza kurejesha unyevu wa kawaida na kibali cha kamasi kwa kutofautisha katika seli za uso wa njia ya hewa zilizosahihishwa na jeni zinazohusiana na cystic fibrosis, na kusababisha manufaa ya maisha yote.Vekta za LV lazima zielekezwe dhidi ya njia za hewa zinazopitisha hewa, kwani hapa ndipo kuhusika kwa mapafu katika CF huanza.Utoaji wa vekta ndani zaidi ya mapafu inaweza kusababisha transduction ya alveolar, lakini hii haina athari ya matibabu katika cystic fibrosis.Hata hivyo, vimiminika kama vile vibeba jeni kwa kawaida huhamia kwenye alveoli vinapovutwa baada ya kuzaa3,4 na chembechembe za matibabu hutupwa haraka ndani ya cavity ya mdomo na MCTs.Ufanisi wa upitishaji wa LV unahusiana moja kwa moja na urefu wa muda ambao vekta inabaki karibu na seli zinazolengwa ili kuruhusu uchukuaji wa seli - "muda wa makazi" 5 ambao unafupishwa kwa urahisi na mtiririko wa hewa wa kawaida wa kikanda pamoja na utumiaji ulioratibiwa wa kamasi na chembe za MCT.Kwa cystic fibrosis, uwezo wa kuongeza muda wa kukaa kwa LV katika njia za hewa ni muhimu ili kufikia viwango vya juu vya upitishaji katika eneo hili, lakini hadi sasa imekuwa changamoto.
Ili kuondokana na kikwazo hiki, tunapendekeza kwamba chembe za sumaku za LV (Wabunge) zinaweza kusaidia kwa njia mbili za ziada.Kwanza, zinaweza kuongozwa na sumaku kwenye uso wa njia ya hewa ili kuboresha ulengaji na kusaidia chembe za kibeba jeni kuwa katika eneo la kulia la njia ya hewa;na ASL) huhamia kwenye safu ya seli ya 6. Wabunge hutumiwa sana kama magari yanayolengwa ya kusambaza dawa wanapofunga kingamwili, dawa za kidini, au molekuli nyingine ndogo ambazo hushikamana na membrane za seli au kushikamana na vipokezi vya uso wa seli husika na kujilimbikiza kwenye tovuti za uvimbe. uwepo wa umeme tuli.Sehemu za sumaku za tiba ya saratani 7. Njia zingine za "hyperthermic" zinalenga kuua seli za tumor kwa kupokanzwa wabunge wakati wanakabiliwa na uwanja wa sumaku wa oscillating.Kanuni ya uhamishaji sumaku, ambapo uga wa sumaku hutumiwa kama wakala wa uambukizaji ili kuimarisha uhamishaji wa DNA hadi kwenye seli, kwa kawaida hutumiwa katika mfumo wa vitro kwa kutumia anuwai ya vekta za jeni zisizo za virusi na virusi kwa njia ngumu kupitisha laini za seli. ..Ufanisi wa magnetotransfection ya LV na utoaji wa MP wa LV katika vitro kwenye mstari wa seli ya epithelium ya bronchi ya binadamu mbele ya uwanja wa magnetic tuli ulianzishwa, na kuongeza ufanisi wa upitishaji kwa mara 186 ikilinganishwa na vector ya LV pekee.LV MT pia imetumika kwa mfano wa in vitro wa cystic fibrosis, ambapo uhamishaji wa sumaku uliongeza upitishaji wa LV katika tamaduni za kiolesura cha kioevu-hewa kwa sababu ya 20 mbele ya cystic fibrosis sputum10.Hata hivyo, magnetotransfection ya kiungo cha vivo imepata uangalizi mdogo na imetathminiwa tu katika tafiti chache za wanyama11,12,13,14,15, hasa katika mapafu16,17.Hata hivyo, uwezekano wa uhamisho wa magnetic katika tiba ya mapafu katika cystic fibrosis ni wazi.Tan na wengine.(2020) ilisema kuwa "utafiti wa uthibitishaji juu ya utoaji bora wa mapafu wa nanoparticles za sumaku utafungua njia kwa mikakati ya baadaye ya kuvuta pumzi ya CFTR ili kuboresha matokeo ya kliniki kwa wagonjwa walio na cystic fibrosis"6.
Tabia ya chembe ndogo za sumaku kwenye uso wa njia ya upumuaji mbele ya uwanja wa sumaku uliotumika ni ngumu kuibua na kusoma, na kwa hivyo hazieleweki vizuri.Katika tafiti nyingine, tumeunda mbinu ya Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) kwa ajili ya upigaji picha usiovamizi na ukadiriaji wa mabadiliko ya dakika katika vivo katika kina cha ASL18 na tabia ya MCT19,20 kupima moja kwa moja ujazo wa uso wa njia ya gesi. na hutumika kama kiashirio cha mapema cha ufanisi wa matibabu.Zaidi ya hayo, mbinu yetu ya kupata alama ya MCT hutumia chembechembe za kipenyo cha 10-35 µm zinazojumuisha alumini au glasi ya kielelezo ya juu inayoakisi kama vialamisho vya MCT vinavyoonekana kwa PB-PCXI21.Njia zote mbili zinafaa kwa taswira ya aina mbalimbali za chembe, wakiwemo wabunge.
Kwa sababu ya azimio la juu la anga na muda, majaribio yetu ya ASL na MCT yenye msingi wa PB-PCXI yanafaa vyema kujifunza mienendo na mifumo ya kitabia ya chembe moja na nyingi katika vivo ili kutusaidia kuelewa na kuboresha mbinu za uwasilishaji jeni za Mbunge.Mbinu tunayotumia hapa inatokana na tafiti zetu kwa kutumia mwala wa SPring-8 BL20B2, ambamo tulionyesha msogeo wa maji kufuatia uwasilishaji wa kipimo cha vekta ya dummy kwenye njia ya hewa ya pua na mapafu ya panya ili kusaidia kuelezea mifumo yetu ya usemi wa jeni tofauti. katika jeni zetu.masomo ya wanyama na kipimo cha carrier cha 3.4.
Kusudi la utafiti huu lilikuwa kutumia synchrotron ya PB-PCXI kuibua harakati za vivo za safu ya wabunge kwenye trachea ya panya hai.Masomo haya ya upigaji picha ya PB-PCXI yaliundwa ili kujaribu mfululizo wa MP, nguvu ya uga wa sumaku, na eneo ili kubaini athari zao kwa harakati za Mbunge.Tulidhani kwamba uga wa sumaku wa nje ungesaidia MF iliyowasilishwa kukaa au kuhamia eneo lengwa.Masomo haya pia yalituruhusu kuamua usanidi wa sumaku ambao huongeza kiwango cha chembe zilizobaki kwenye trachea baada ya utuaji.Katika mfululizo wa pili wa tafiti, tulilenga kutumia usanidi huu bora ili kuonyesha muundo wa upitishaji unaotokana na utoaji vivo wa wabunge wa LV kwa njia za hewa za panya, kwa kudhani kuwa uwasilishaji wa Wabunge wa LV katika muktadha wa ulengaji wa njia ya hewa ungesababisha. katika kuongezeka kwa ufanisi wa upitishaji wa LV..
Masomo yote ya wanyama yalifanywa kwa mujibu wa itifaki zilizoidhinishwa na Chuo Kikuu cha Adelaide (M-2019-060 na M-2020-022) na Kamati ya Maadili ya Wanyama ya SPring-8 Synchrotron.Majaribio yalifanywa kwa mujibu wa mapendekezo ya WASILI.
Picha zote za eksirei zilichukuliwa kwenye mstari wa boriti wa BL20XU kwenye synchrotron ya SPring-8 nchini Japani kwa kutumia usanidi sawa na ule ulioelezwa hapo awali21,22.Kwa kifupi, kisanduku cha majaribio kilipatikana mita 245 kutoka kwa pete ya kuhifadhi ya synchrotron.Umbali wa sampuli hadi kigunduzi wa mita 0.6 hutumika kwa masomo ya upigaji picha wa chembe na mita 0.3 kwa tafiti za upigaji picha za vivo ili kuunda athari za utofautishaji wa awamu.Boriti ya monochromatic yenye nishati ya 25 keV ilitumiwa.Picha hizo zilipatikana kwa kutumia transducer ya X-ray ya ubora wa juu (SPring-8 BM3) iliyounganishwa na kigunduzi cha sCMOS.Transducer hubadilisha mionzi ya X hadi mwanga unaoonekana kwa kutumia scintillator nene ya 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), ambayo huelekezwa kwenye kihisi cha sCMOS kwa kutumia lengo la hadubini ×10 (NA 0.3).Kigunduzi cha sCMOS kilikuwa Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japani) chenye ukubwa wa safu ya pikseli 2048 × 2048 na saizi mbichi ya pikseli 6.5 × 6.5 µm.Mpangilio huu unatoa saizi bora ya pikseli ya isotropiki ya 0.51 µm na uga wa mwonekano wa takriban 1.1 mm × 1.1 mm.Muda wa kukaribia wa ms 100 ulichaguliwa ili kuongeza uwiano kati ya mawimbi na kelele wa chembe za sumaku ndani na nje ya njia za hewa huku ikipunguza vizalia vya mwendo vinavyosababishwa na kupumua.Kwa masomo ya vivo, shutter ya haraka ya X-ray iliwekwa kwenye njia ya X-ray ili kupunguza kipimo cha mionzi kwa kuzuia boriti ya X-ray kati ya mfiduo.
Vyombo vya habari vya LV havikutumika katika tafiti zozote za upigaji picha za SPring-8 PB-PCXI kwa sababu chumba cha kupiga picha cha BL20XU hakijaidhinishwa na Kiwango cha 2 cha Usalama wa Uhai.Badala yake, tulichagua aina mbalimbali za wabunge wenye sifa nzuri kutoka kwa wachuuzi wawili wa kibiashara wanaoshughulikia ukubwa, nyenzo, viwango vya chuma, na matumizi , - kwanza ili kuelewa jinsi sehemu za sumaku zinavyoathiri harakati za Wabunge katika kapilari za glasi, na kisha njia za hewa hai.uso.Ukubwa wa mbunge hutofautiana kutoka 0.25 hadi 18 µm na hutengenezwa kutoka kwa nyenzo mbalimbali (tazama Jedwali 1), lakini muundo wa kila sampuli, ikiwa ni pamoja na ukubwa wa chembe za sumaku katika Mbunge, haujulikani.Kulingana na tafiti zetu za kina za MCT 19, 20, 21, 23, 24, tunatarajia kwamba wabunge chini ya 5 µm wanaweza kuonekana kwenye eneo la njia ya hewa ya mirija, kwa mfano, kwa kutoa fremu zinazofuatana ili kuona mwonekano bora wa harakati za Mbunge.Mbunge mmoja wa 0.25 µm ni mdogo kuliko azimio la kifaa cha kupiga picha, lakini PB-PCXI inatarajiwa kugundua utofautishaji wao wa ujazo na msogeo wa kioevu cha uso ambamo huwekwa baada ya kuwekwa.
Sampuli za kila mbunge kwenye jedwali.1 ilitayarishwa katika kapilari za glasi 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) na kipenyo cha ndani cha 0.63 mm.Chembe za corpuscular zinapatikana katika maji, ilhali chembe za CombiMag zinapatikana katika kioevu cha umiliki wa mtengenezaji.Kila mrija hujazwa nusu na kioevu (takriban 11 µl) na kuwekwa kwenye kishikilia sampuli (ona Mchoro 1).Capillaries za kioo ziliwekwa kwa usawa kwenye hatua katika chumba cha picha, kwa mtiririko huo, na kuwekwa kwenye kando ya kioevu.Sumaku ya ganda la nikeli yenye kipenyo cha mm 19 (urefu wa mm 28) iliyotengenezwa kwa udongo adimu, neodymium, chuma na boroni (NdFeB) (N35, paka nambari LM1652, Jaycar Electronics, Australia) yenye masalio ya 1.17 T iliunganishwa kwenye Jedwali tofauti la uhamishaji ili kufikia ubadilishe msimamo wako kwa mbali wakati wa uwasilishaji.Upigaji picha wa X-ray huanza wakati sumaku imewekwa takriban 30 mm juu ya sampuli na picha hupatikana kwa fremu 4 kwa sekunde.Wakati wa kupiga picha, sumaku ililetwa karibu na bomba la capillary la glasi (kwa umbali wa karibu 1 mm) na kisha ikasogezwa kando ya bomba ili kutathmini athari ya nguvu ya shamba na msimamo.
Mipangilio ya picha ya ndani iliyo na sampuli za Mbunge katika kapilari za kioo katika hatua ya tafsiri ya sampuli ya xy.Njia ya boriti ya X-ray imewekwa na mstari wa dotted nyekundu.
Mara tu mwonekano wa ndani wa Wabunge ulipoanzishwa, kikundi kidogo chao kilijaribiwa vivo kwa panya wa kike aina ya Wistar albino (~umri wa wiki 12, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) na butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Panya walilazimishwa na mchanganyiko wa Pharma (Japani) kwa sindano ya intraperitoneal.Baada ya ganzi, zilitayarishwa kwa ajili ya kupiga picha kwa kuondoa manyoya karibu na mirija ya mirija, kuingiza mrija wa mwisho wa mshipa (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), na kuwazuia katika nafasi ya chali kwenye sahani ya picha iliyotengenezwa maalum iliyo na mfuko wa joto. kudumisha joto la mwili.22. Bamba la kupiga picha liliambatishwa kwenye hatua ya sampuli katika kisanduku cha kupiga picha kwa pembe kidogo ili kupanga mirija ya utiaji mlalo kwenye picha ya eksirei kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 2a.
(a) Katika uwekaji picha wa vivo katika kitengo cha kupiga picha cha SPring-8, njia ya boriti ya X-ray iliyo na alama ya mstari wa nukta nyekundu.(b,c) Ujanibishaji wa sumaku ya tracheal ulifanyika kwa mbali kwa kutumia kamera mbili za IP zilizowekwa kwa njia ya othogonal.Katika upande wa kushoto wa picha kwenye skrini, unaweza kuona kitanzi cha waya kilichoshikilia kichwa na kanula ya uwasilishaji iliyosakinishwa ndani ya bomba la ET.
Mfumo wa pampu ya sirinji inayodhibitiwa kwa mbali (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) kwa kutumia sindano ya kioo yenye µl 100 uliunganishwa kwenye neli ya PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) kwa kutumia sindano ya Ga 30.Weka alama kwenye bomba ili kuhakikisha kuwa ncha iko katika nafasi sahihi kwenye trachea wakati wa kuingiza bomba la endotracheal.Kwa kutumia pampu ndogo, bomba la sindano lilitolewa na ncha ya bomba ilitumbukizwa kwenye sampuli ya Mbunge itakayotolewa.Kisha mirija ya kuwasilisha iliyopakiwa iliingizwa kwenye mirija ya mwisho ya utitiri, na kuweka ncha kwenye sehemu yenye nguvu zaidi ya uga wetu wa sumaku unaotarajiwa.Upatikanaji wa picha ulidhibitiwa kwa kutumia kitambua pumzi kilichounganishwa kwenye kisanduku chetu cha saa kinachotegemea Arduino, na mawimbi yote (km, halijoto, upumuaji, uwazi wa shutter, na upataji wa picha) zilirekodiwa kwa kutumia Powerlab na LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Wakati wa Kupiga Picha Nyumba ilipokosekana, kamera mbili za IP (Panasonic BB-SC382) ziliwekwa kwa takriban 90 ° kwa kila mmoja na kutumika kudhibiti nafasi ya sumaku kuhusiana na trachea wakati wa kupiga picha (Mchoro 2b, c).Ili kupunguza vizalia vya programu vinavyosonga, picha moja kwa kila pumzi ilipatikana wakati wa safu ya mwisho ya mtiririko wa kupumua.
Sumaku imeunganishwa kwenye hatua ya pili, ambayo inaweza kuwa iko kwa mbali nje ya mwili wa picha.Nafasi na mipangilio mbalimbali ya sumaku ilijaribiwa, ikiwa ni pamoja na: kuwekwa kwa pembe ya takriban 30 ° juu ya trachea (mipangilio imeonyeshwa kwenye Mchoro 2a na 3a);sumaku moja juu ya mnyama na nyingine chini, na nguzo zimewekwa kwa ajili ya kuvutia (Mchoro 3b)., sumaku moja juu ya mnyama na moja chini, na miti iliyowekwa kwa ajili ya kukataa (Mchoro 3c), na sumaku moja juu na perpendicular kwa trachea (Mchoro 3d).Baada ya kusanidi mnyama na sumaku na kupakia MP inayojaribiwa kwenye pampu ya sindano, toa kipimo cha 50 µl kwa kiwango cha 4 µl/sekunde baada ya kupata picha.Kisha sumaku husogezwa mbele na nyuma kando au kupitia trachea huku ikiendelea kupata picha.
Usanidi wa sumaku kwa picha ya vivo (a) sumaku moja juu ya trachea kwa pembe ya takriban 30°, (b) sumaku mbili zilizosanidiwa kwa ajili ya kuvutia, (c) sumaku mbili zilizosanidiwa kwa ajili ya kurudisha nyuma, (d) sumaku moja juu na inayoelekea kwenye trachea.Mtazamaji alitazama chini kutoka mdomo hadi kwenye mapafu kupitia trachea na boriti ya X-ray ikapitia upande wa kushoto wa panya na kutoka upande wa kulia.Sumaku huhamishwa kwa urefu wa njia ya hewa au kushoto na kulia juu ya trachea kwa mwelekeo wa boriti ya X-ray.
Pia tulitafuta kubainisha mwonekano na tabia ya chembechembe kwenye njia za hewa bila kuchanganya kupumua na mapigo ya moyo.Kwa hiyo, mwishoni mwa kipindi cha kupiga picha, wanyama waliadhibiwa kwa kibinadamu kutokana na overdose ya pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Wanyama wengine waliachwa kwenye jukwaa la kupiga picha, na baada ya kusitishwa kwa kupumua na mapigo ya moyo, mchakato wa kupiga picha ulirudiwa, na kuongeza dozi ya ziada ya Mbunge ikiwa hakuna mbunge aliyeonekana kwenye uso wa njia ya hewa.
Picha zilizotokana zilisahihishwa kwa uga tambarare na giza kisha kuunganishwa kuwa filamu (fremu 20 kwa sekunde; 15–25 × kasi ya kawaida kulingana na kasi ya kupumua) kwa kutumia hati maalum iliyoandikwa katika MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Masomo yote juu ya utoaji wa vekta ya jeni ya LV yalifanyika katika Kituo cha Utafiti wa Wanyama cha Maabara ya Adelaide na ililenga kutumia matokeo ya jaribio la SPring-8 kutathmini ikiwa utoaji wa LV-MP mbele ya uwanja wa sumaku unaweza kuongeza uhamishaji wa jeni katika vivo. .Ili kutathmini athari za MF na shamba la sumaku, vikundi viwili vya wanyama vilitibiwa: kikundi kimoja kilidungwa na LV MF na uwekaji wa sumaku, na kikundi kingine hudungwa na kikundi cha kudhibiti na LV MF bila sumaku.
Vekta za jeni za LV zimezalishwa kwa kutumia mbinu zilizoelezwa hapo awali 25, 26 .Vekta ya LacZ inaonyesha jeni ya nyuklia ya beta-galactosidase inayoendeshwa na kikuzaji cha MPSV (LV-LacZ), ambayo hutoa bidhaa ya mmenyuko wa bluu katika seli zilizobadilishwa, zinazoonekana kwenye sehemu za mbele na sehemu za tishu za mapafu.Titration ilifanywa katika tamaduni za seli kwa kuhesabu mwenyewe idadi ya seli za LacZ-chanya kwa kutumia hemocytometer ili kukokotoa titer katika TU/ml.Vibebaji huhifadhiwa kwenye joto -80 ° C, huyeyushwa kabla ya matumizi, na hufungwa kwa CombiMag kwa kuchanganya 1: 1 na kuangazia kwenye barafu kwa angalau dakika 30 kabla ya kujifungua.
Panya wa kawaida wa Sprague Dawley (n = 3/kikundi, ~ 2-3 ip iliyosisitizwa na mchanganyiko wa 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) na 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) katika umri wa mwezi 1) ip ) sindano na kanula ya mdomo isiyo ya upasuaji kwa 16 Ga kanula ya mishipa.Ili kuhakikisha kwamba tishu za njia ya hewa ya tundu la hewa hupokea upitishaji wa LV, iliwekwa kwa kutumia itifaki yetu ya upotoshaji ya mitambo iliyoelezwa hapo awali ambapo uso wa njia ya hewa ya tracheal ulisuguliwa kwa mhimili na kikapu cha waya (N-Circle, kichimbaji cha mawe ya nitinol bila ncha NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, Marekani) 30 p28.Kisha, kama dakika 10 baada ya usumbufu katika baraza la mawaziri la usalama wa viumbe, utawala wa trachea wa LV-MP ulifanyika.
Uga wa sumaku uliotumika katika jaribio hili ulisanidiwa sawa na uchunguzi wa eksirei wa in vivo, huku sumaku zile zile zikiwa zimeshikiliwa juu ya trachea na vibano vya kunereka vya kunereka (Mchoro 4).Kiasi cha 50 µl (aliquots 2 x 25 µl) za LV-MP kiliwasilishwa kwa trachea (n = wanyama 3) kwa kutumia pipette yenye ncha ya gel kama ilivyoelezwa hapo awali.Kikundi cha kudhibiti (n = wanyama 3) kilipokea LV-MP sawa bila matumizi ya sumaku.Baada ya kukamilika kwa infusion, cannula huondolewa kwenye tube ya endotracheal na mnyama hutolewa.Sumaku inabaki mahali kwa dakika 10 kabla ya kuondolewa.Panya waliwekwa chini ya ngozi na meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) ikifuatiwa na kuondolewa kwa ganzi kwa kudungwa ndani ya peritoneal ya 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Panya ziliwekwa joto na kuzingatiwa hadi kupona kamili kutoka kwa anesthesia.
Kifaa cha uwasilishaji cha LV-MP katika baraza la mawaziri la usalama wa kibaolojia.Unaweza kuona kwamba sleeve ya kijivu nyepesi ya Luer-lock ya tube ya ET inatoka kinywa, na ncha ya pipette ya gel iliyoonyeshwa kwenye takwimu imeingizwa kupitia bomba la ET hadi kina kinachohitajika kwenye trachea.
Wiki moja baada ya utaratibu wa usimamizi wa LV-MP, wanyama walitolewa dhabihu kwa ubinadamu kwa kuvuta pumzi ya 100% CO2 na usemi wa LacZ ulitathminiwa kwa kutumia matibabu yetu ya kawaida ya X-gal.Pete tatu za cartilage zaidi ya caudal ziliondolewa ili kuhakikisha kuwa uharibifu wowote wa mitambo au uhifadhi wa maji kwa sababu ya uwekaji wa tube ya endotracheal hautajumuishwa katika uchanganuzi.Kila trachea ilikatwa kwa urefu ili kupata nusu mbili za uchanganuzi na kuwekwa kwenye kikombe kilicho na mpira wa silikoni (Sylgard, Dow Inc) kwa kutumia sindano ya Minutien (Zana za Sayansi Fine) ili kuibua uso wa mwanga.Usambazaji na tabia ya seli zilizobadilishwa zilithibitishwa na upigaji picha wa mbele kwa kutumia darubini ya Nikon (SMZ1500) yenye kamera ya DigiLite na programu ya TCapture (Tucsen Photonics, Uchina).Picha zilipatikana kwa ukuzaji wa 20x (ikiwa ni pamoja na mpangilio wa juu zaidi wa upana kamili wa trachea), na urefu wote wa trachea ulionyeshwa hatua kwa hatua, ikitoa mwingiliano wa kutosha kati ya kila picha ili kuruhusu picha "kuunganishwa".Kisha picha kutoka kwa kila trachea ziliunganishwa kuwa picha ya mchanganyiko kwa kutumia Composite Image Editor toleo la 2.0.3 (Utafiti wa Microsoft) kwa kutumia algoriti ya mwendo iliyopangwa. Eneo la msemo wa LacZ ndani ya picha za mchanganyiko wa mirija kutoka kwa kila mnyama lilibainishwa kwa kutumia hati otomatiki ya MATLAB (R2020a, MathWorks) kama ilivyoelezwa hapo awali28, kwa kutumia mipangilio ya 0.35 < Hue <0.58, Kueneza > 0.15, na Thamani <0.7. Eneo la usemi wa LacZ ndani ya picha za mchanganyiko wa mirija kutoka kwa kila mnyama lilithibitishwa kwa hati ya otomatiki ya MATLAB (R2020a, MathWorks) kama ilivyoelezwa hapo awali28, kwa kutumia mipangilio ya 0.35 < Hue <0.58, Kueneza > 0.15, na Thamani <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Eneo la usemi wa LacZ katika picha zenye mchanganyiko wa mirija kutoka kwa kila mnyama lilibainishwa kwa kutumia hati ya otomatiki ya MATLAB (R2020a, MathWorks) kama ilivyoelezwa hapo awali28 kwa kutumia mipangilio ya 0.350.15 na thamani<0 .7.如 前所.如 前所 述 述 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a, Mathworks） 来自 每 只 的 复合 图像 的..................... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Maeneo ya usemi wa LacZ kwenye picha zenye mchanganyiko za trachea ya kila mnyama yalibainishwa kwa kutumia hati ya otomatiki ya MATLAB (R2020a, MathWorks) kama ilivyoelezwa hapo awali kwa kutumia mipangilio ya 0.35 < hue <0.58, saturation > 0.15 na thamani <0.7 .Kwa kufuatilia mtaro wa tishu katika GIMP v2.10.24, barakoa iliundwa kwa mikono kwa kila picha ya mchanganyiko ili kutambua eneo la tishu na kuzuia ugunduzi wowote wa uwongo nje ya tishu za trachea.Maeneo yenye madoa kutoka kwa picha zote za mchanganyiko kutoka kwa kila mnyama yalijumlishwa ili kutoa jumla ya eneo lenye madoa kwa mnyama huyo.Eneo la rangi liligawanywa na eneo la jumla la mask ili kupata eneo la kawaida.
Kila trachea ilipachikwa kwenye mafuta ya taa na kugawanywa kwa unene wa 5 µm.Sehemu zilizuiliwa na rangi nyekundu isiyofungamana na upande wowote kwa dakika 5 na picha zilipatikana kwa kutumia darubini ya Nikon Eclipse E400, kamera ya DS-Fi3 na programu ya kunasa kipengele cha NIS (toleo la 5.20.00).
Uchambuzi wote wa takwimu ulifanyika katika GraphPad Prism v9 (Programu ya GraphPad, Inc.).Umuhimu wa takwimu umewekwa kwa p ≤ 0.05.Hali ya kawaida ilijaribiwa kwa kutumia jaribio la Shapiro-Wilk na tofauti katika uwekaji madoa wa LacZ zilitathminiwa kwa kutumia mtihani wa t ambao haujaoanishwa.
Wabunge sita waliofafanuliwa katika Jedwali 1 walichunguzwa na PCXI, na mwonekano umeelezewa katika Jedwali 2. Wabunge wawili wa polystyrene (MP1 na MP2; 18 µm na 0.25 µm, mtawalia) hawakuonekana na PCXI, lakini sampuli zilizobaki zinaweza kutambuliwa. (mifano imeonyeshwa kwenye Mchoro 5).MP3 na MP4 zinaonekana hafifu (10-15% Fe3O4; 0.25 µm na 0.9 µm, mtawalia).Ingawa MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) ilikuwa na baadhi ya chembe ndogo zaidi zilizojaribiwa, ndiyo iliyotamkwa zaidi.Bidhaa ya CombiMag MP6 ni ngumu kutofautisha.Katika hali zote, uwezo wetu wa kutambua MF uliboreshwa sana kwa kusogeza sumaku nyuma na mbele sambamba na kapilari.Sumaku ziliposogea mbali na kapilari, chembe hizo zilitolewa kwa minyororo mirefu, lakini sumaku zilipokaribia na nguvu ya uga wa sumaku kuongezeka, minyororo ya chembechembe ilifupishwa huku chembe hizo zikihamia sehemu ya juu ya kapilari (tazama Video ya Nyongeza S1). : MP4), kuongeza msongamano wa chembe kwenye uso.Kinyume chake, sumaku inapoondolewa kwenye kapilari, nguvu ya shamba hupungua na wabunge hujipanga upya katika minyororo mirefu inayotoka kwenye uso wa juu wa kapilari (tazama Video ya Nyongeza S2: MP4).Baada ya sumaku kuacha kusonga, chembe zinaendelea kusonga kwa muda baada ya kufikia nafasi ya usawa.Mbunge anaposonga kuelekea na kutoka kwenye uso wa juu wa kapilari, chembe za sumaku huwa na kuteka uchafu kupitia kioevu.
Mwonekano wa Mbunge chini ya PCXI hutofautiana sana kati ya sampuli.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 na (d) MP6.Picha zote zilizoonyeshwa hapa zilichukuliwa na sumaku iliyowekwa takriban 10 mm moja kwa moja juu ya kapilari.Miduara mikubwa inayoonekana ni viputo vya hewa vilivyonaswa kwenye kapilari, vinaonyesha wazi vipengele vya makali nyeusi na nyeupe ya picha ya utofautishaji wa awamu.Sanduku nyekundu linaonyesha ukuzaji ambao huongeza tofauti.Kumbuka kwamba kipenyo cha mizunguko ya sumaku katika takwimu zote si kwa kiwango na ni takriban mara 100 zaidi kuliko inavyoonyeshwa.
Sumaku inaposogea kushoto na kulia kando ya sehemu ya juu ya kapilari, pembe ya kamba ya Mbunge hubadilika ili iendane na sumaku (ona Mchoro 6), hivyo basi kubainisha mistari ya uga wa sumaku.Kwa MP3-5, baada ya chord kufikia pembe ya kizingiti, chembe huvuta kando ya uso wa juu wa capillary.Hii mara nyingi husababisha Wabunge kukusanyika katika vikundi vikubwa karibu na mahali ambapo uga wa sumaku una nguvu zaidi (tazama Video ya Nyongeza S3: MP5).Hii pia inaonekana hasa wakati wa kupiga picha karibu na mwisho wa capillary, ambayo husababisha mbunge kukusanya na kuzingatia kwenye interface ya kioevu-hewa.Chembe katika MP6, ambazo zilikuwa ngumu kutofautisha kuliko zile za MP3-5, hazikuburuta wakati sumaku iliposogea kando ya kapilari, lakini nyuzi za Mbunge zilijitenga, na kuacha chembe kwenye mwonekano (tazama Supplementary Video S4: MP6).Katika baadhi ya matukio, wakati uga wa sumaku uliowekwa ulipopunguzwa kwa kusogeza sumaku umbali mrefu kutoka kwa tovuti ya kupiga picha, Wabunge wowote waliobaki walishuka polepole hadi sehemu ya chini ya bomba kwa nguvu ya uvutano, iliyobaki kwenye kamba (tazama Video ya Nyongeza S5: MP3) .
Pembe ya kamba ya Mbunge hubadilika sumaku inaposogea upande wa kulia juu ya kapilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 na (d) MP6.Sanduku nyekundu linaonyesha ukuzaji ambao huongeza tofauti.Tafadhali kumbuka kuwa video za ziada ni kwa madhumuni ya taarifa kwani zinaonyesha muundo wa chembe muhimu na maelezo yanayobadilika ambayo hayawezi kuonyeshwa katika picha hizi tuli.
Majaribio yetu yameonyesha kuwa kusonga sumaku nyuma na mbele polepole kando ya trachea kuwezesha taswira ya MF katika muktadha wa harakati ngumu katika vivo.Vipimo vya No in vivo vilifanywa kwa sababu shanga za polystyrene (MP1 na MP2) hazikuonekana kwenye kapilari.Kila moja ya MFs nne zilizobaki ilijaribiwa katika vivo na mhimili mrefu wa sumaku umewekwa juu ya trachea kwa pembe ya takriban 30 ° hadi wima (ona Mchoro 2b na 3a), kwa kuwa hii ilisababisha minyororo mirefu ya MF na ilikuwa na ufanisi zaidi. kuliko sumaku..usanidi umekatishwa.MP3, MP4 na MP6 hazijapatikana kwenye trachea ya wanyama wowote hai.Wakati wa kuibua njia ya upumuaji ya panya baada ya kuua wanyama kwa kibinadamu, chembe hizo zilibaki zisizoonekana hata wakati kiasi cha ziada kiliongezwa kwa kutumia pampu ya sindano.MP5 ilikuwa na maudhui ya juu zaidi ya oksidi ya chuma na ilikuwa chembe pekee inayoonekana, kwa hivyo ilitumiwa kutathmini na kubainisha tabia ya Mbunge katika vivo.
Uwekaji wa sumaku juu ya trachea wakati wa kuingizwa kwa MF ulisababisha wengi, lakini sio wote, MFs kujilimbikizia katika uwanja wa mtazamo.Kuingia kwa trachea ya chembe huzingatiwa vyema katika wanyama walioachiliwa kwa kibinadamu.Kielelezo cha 7 na Video ya Nyongeza S6: MP5 inaonyesha kunasa kwa kasi kwa sumaku na upangaji wa chembe kwenye uso wa mirija ya hewa, ikionyesha kuwa Wabunge wanaweza kulengwa kwa maeneo yanayohitajika ya trachea.Wakati wa kutafuta kwa mbali zaidi kwenye trachea baada ya utoaji wa MF, baadhi ya MFs zilipatikana karibu na carina, ambayo inaonyesha kutosha kwa nguvu ya shamba la magnetic kukusanya na kushikilia MF zote, kwa vile zilitolewa kupitia eneo la nguvu ya juu ya shamba la magnetic wakati wa utawala wa maji.mchakato.Hata hivyo, viwango vya wabunge baada ya kuzaa vilikuwa juu zaidi karibu na eneo la picha, na hivyo kupendekeza kuwa wabunge wengi walibaki katika maeneo ya njia za hewa ambapo nguvu ya uga wa sumaku iliyotumika ilikuwa ya juu zaidi.
Picha za (a) kabla na (b) baada ya kuwasilishwa kwa MP5 kwenye trachea ya panya aliyejeruhiwa hivi karibuni na sumaku iliyowekwa juu ya eneo la kupiga picha.Eneo lililoonyeshwa liko kati ya pete mbili za cartilaginous.Kuna maji maji kwenye njia za hewa kabla ya mbunge kufikishwa.Sanduku nyekundu linaonyesha ukuzaji ambao huongeza tofauti.Picha hizi zimechukuliwa kutoka kwa video iliyoangaziwa katika S6: Video ya Nyongeza ya MP5.
Kusonga sumaku kwenye trachea katika vivo kulisababisha mabadiliko katika pembe ya mnyororo wa Mbunge kwenye uso wa njia ya hewa, sawa na ile iliyoonekana kwenye kapilari (ona Mchoro 8 na Video ya Nyongeza S7: MP5).Walakini, katika utafiti wetu, Wabunge hawakuweza kuburutwa kwenye uso wa njia za upumuaji, kama vile capillaries inaweza kufanya.Katika baadhi ya matukio, mnyororo wa Mbunge hurefuka sumaku inaposogea kushoto na kulia.Jambo la kufurahisha ni kwamba tuligundua pia kwamba mnyororo wa chembe hubadilisha kina cha safu ya uso wa giligili wakati sumaku inaposogezwa kwa muda mrefu kando ya trachea, na hupanuka wakati sumaku inapohamishwa moja kwa moja juu na mnyororo wa chembe huzungushwa hadi nafasi ya wima (ona. Video ya Nyongeza S7).: MP5 saa 0:09, chini kulia).Mwenendo wa tabia ulibadilika sumaku iliposogezwa kando juu ya trachea (yaani, kushoto au kulia kwa mnyama, badala ya urefu wa trachea).Chembe bado zilionekana wazi wakati wa harakati zao, lakini wakati sumaku iliondolewa kwenye trachea, vidokezo vya kamba za chembe zilionekana (tazama Supplementary Video S8: MP5, kuanzia 0:08).Hii inakubaliana na tabia inayozingatiwa ya uwanja wa sumaku chini ya hatua ya uwanja wa sumaku uliowekwa kwenye kapilari ya glasi.
Sampuli za picha zinazoonyesha MP5 kwenye trachea ya panya aliye hai mwenye ganzi.(a) Sumaku hutumika kupata picha juu na upande wa kushoto wa trachea, kisha (b) baada ya kusogeza sumaku kulia.Sanduku nyekundu linaonyesha ukuzaji ambao huongeza tofauti.Picha hizi ni kutoka kwa video iliyoangaziwa katika Video ya Nyongeza ya S7: MP5.
Wakati nguzo mbili zilipangwa katika mwelekeo wa kaskazini-kusini juu na chini ya trachea (yaani, kuvutia; Kielelezo 3b), nyimbo za Mbunge zilionekana kwa muda mrefu na ziliwekwa kwenye ukuta wa kando wa trachea badala ya juu ya uso wa mgongo wa trachea. trachea (tazama Kiambatisho).Video S9:MP5).Hata hivyo, viwango vya juu vya chembe kwenye tovuti moja (yaani, uso wa mgongo wa trachea) haukugunduliwa baada ya utawala wa maji kwa kutumia kifaa cha sumaku mbili, ambacho hutokea kwa kifaa kimoja cha sumaku.Kisha, wakati sumaku moja iliundwa kurudisha miti iliyo kinyume (Mchoro 3c), idadi ya chembe zinazoonekana kwenye uwanja wa mtazamo hazikuongezeka baada ya kujifungua.Kuweka usanidi wa sumaku zote mbili ni changamoto kutokana na uga wa juu wa sumaku ambao huvutia au kusukuma sumaku mtawalia.Mpangilio ulibadilishwa na kuwa sumaku moja inayofanana na njia za hewa lakini ikipitia njia za hewa kwa pembe ya digrii 90 ili mistari ya nguvu ivuke ukuta wa trachea kwa njia ya orthogonally (Kielelezo 3d), mwelekeo uliokusudiwa kuamua uwezekano wa kuunganishwa kwa chembe. ukuta wa pembeni.kuzingatiwa.Hata hivyo, katika usanidi huu, hapakuwa na harakati za mkusanyo wa MF zinazotambulika au harakati za sumaku.Kulingana na matokeo haya yote, usanidi na sumaku moja na mwelekeo wa digrii 30 ulichaguliwa kwa masomo ya vivo ya wabebaji wa jeni (Mchoro 3a).
Mnyama alipopigwa picha mara nyingi mara tu baada ya kutolewa dhabihu ya kibinadamu, kukosekana kwa mwendo wa tishu unaoingilia kulimaanisha kuwa mistari laini zaidi, mifupi ya chembe ingeweza kutambulika katika uga ulio wazi kati ya kikaratasi, 'kuyumba-yumba' kwa mujibu wa mwendo wa kutafsiri wa sumaku.tazama wazi uwepo na harakati za chembe za MP6.
Kiini cha LV-LacZ kilikuwa 1.8 x 108 IU/mL, na baada ya kuchanganya 1:1 na CombiMag MP (MP6), wanyama walidungwa 50 µl ya dozi ya trachea ya 9 x 107 IU/ml ya gari la LV (yaani 4.5 x 106 TU/panya).)).Katika masomo haya, badala ya kusonga sumaku wakati wa leba, tuliweka sumaku katika nafasi moja ili kubaini ikiwa upitishaji wa LV ungeweza (a) kuboreshwa ikilinganishwa na uwasilishaji wa vekta bila uga wa sumaku, na (b) ikiwa njia ya hewa inaweza. kuwa na umakini.Seli zinazopitishwa katika maeneo yanayolengwa ya sumaku ya njia ya juu ya upumuaji.
Uwepo wa sumaku na utumiaji wa CombiMag pamoja na vekta za LV haukuonekana kuathiri vibaya afya ya wanyama, kama vile itifaki yetu ya kawaida ya utoaji wa vekta ya LV.Picha za mbele za eneo la trachea zilizoathiriwa na uharibifu wa mitambo (Mchoro wa ziada wa 1) ulionyesha kuwa kikundi cha kutibiwa cha LV-MP kilikuwa na viwango vya juu vya transduction mbele ya sumaku (Mchoro 9a).Kiasi kidogo tu cha rangi ya bluu ya LacZ ilikuwepo kwenye kikundi cha udhibiti (Mchoro 9b).Ukadiriaji wa mikoa ya kawaida ya X-Gal-stained ilionyesha kuwa utawala wa LV-MP mbele ya uwanja wa magnetic ulisababisha uboreshaji wa takriban mara 6 (Mchoro 9c).
Mfano wa picha za mchanganyiko zinazoonyesha ubadilishaji wa mirija na LV-MP (a) mbele ya uwanja wa sumaku na (b) bila sumaku.(c) Uboreshaji muhimu wa kitakwimu katika eneo la kawaida la upitishaji wa LacZ kwenye trachea kwa kutumia sumaku (*p = 0.029, t-test, n = 3 kwa kila kikundi, inamaanisha ± kosa la wastani la wastani).
Sehemu zilizo na rangi nyekundu zisizo na haraka (mfano ulioonyeshwa kwenye Kielelezo cha 2 cha Nyongeza) ulionyesha kuwa visanduku vilivyo na LacZ vilikuwepo kwenye sampuli sawa na katika eneo sawa na ilivyoripotiwa hapo awali.
Changamoto muhimu katika matibabu ya jeni ya njia ya hewa inabakia ujanibishaji sahihi wa chembe za vibebaji katika maeneo ya kupendeza na kufikiwa kwa kiwango cha juu cha ufanisi wa upitishaji katika mapafu ya rununu mbele ya mtiririko wa hewa na kibali cha ute hai.Kwa wabebaji wa LV wanaokusudiwa kutibu magonjwa ya upumuaji katika cystic fibrosis, kuongeza muda wa kukaa kwa chembe za carrier kwenye njia za hewa za upitishaji imekuwa lengo lisiloweza kufikiwa hadi sasa.Kama ilivyoonyeshwa na Castellani et al., utumiaji wa sehemu za sumaku ili kuboresha upitishaji kuna faida zaidi ya mbinu zingine za uwasilishaji wa jeni kama vile upitishaji umeme kwa sababu inaweza kuchanganya urahisi, uchumi, uwasilishaji wa ndani, kuongezeka kwa ufanisi, na muda mfupi wa incubation.na ikiwezekana kiwango cha chini cha gari10.Walakini, utuaji wa vivo na tabia ya chembe za sumaku kwenye njia za hewa chini ya ushawishi wa nguvu za sumaku za nje hazijawahi kuelezewa, na kwa kweli uwezo wa njia hii kuongeza viwango vya usemi wa jeni katika njia za hewa zilizo hai haijawahi kuonyeshwa katika vivo.
Majaribio yetu ya in vitro kwenye synchrotron ya PCXI yalionyesha kuwa chembe zote tulizojaribiwa, isipokuwa MP polystyrene, zilionekana katika usanidi wa picha tuliotumia.Katika uwepo wa shamba la magnetic, mashamba ya sumaku huunda kamba, urefu ambao unahusiana na aina ya chembe na nguvu ya shamba la magnetic (yaani, ukaribu na harakati ya sumaku).Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 10, mifuatano tunayoona huundwa huku kila chembe moja ikipata sumaku na kushawishi uga wake wa ndani wa sumaku.Sehemu hizi tofauti husababisha chembe zingine zinazofanana kukusanya na kuunganishwa na miondoko ya kamba ya kikundi kutokana na nguvu za ndani kutoka kwa nguvu za ndani za mvuto na kukataa kwa chembe nyingine.
Mchoro unaoonyesha (a, b) misururu ya chembe zinazounda ndani ya kapilari zilizojaa maji na (c, d) trachea iliyojaa hewa.Kumbuka kwamba capillaries na trachea hazitolewa kwa kiwango.Paneli (a) pia ina maelezo ya MF iliyo na chembe za Fe3O4 zilizopangwa kwa minyororo.
Wakati sumaku ikisonga juu ya kapilari, pembe ya kamba ya chembe ilifikia kizingiti muhimu kwa MP3-5 iliyo na Fe3O4, baada ya hapo kamba ya chembe haikubaki tena katika nafasi yake ya awali, lakini ilihamia kando ya uso kwenye nafasi mpya.sumaku.Athari hii inaweza kutokea kwa sababu uso wa kapilari ya glasi ni laini ya kutosha kuruhusu harakati hii kutokea.Inashangaza, MP6 (CombiMag) haikufanya hivi, labda kwa sababu chembechembe zilikuwa ndogo zaidi, zilikuwa na mipako tofauti au chaji ya uso, au kiowevu cha mtoa huduma wa umiliki kiliathiri uwezo wao wa kusonga.Tofauti katika taswira ya chembe ya CombiMag pia ni dhaifu, ikipendekeza kuwa kioevu na chembe zinaweza kuwa na msongamano sawa na kwa hivyo haziwezi kusonga mbele kwa urahisi.Chembe pia zinaweza kukwama ikiwa sumaku itasogea haraka sana, jambo linaloonyesha kwamba nguvu ya uga wa sumaku haiwezi kila wakati kushinda msuguano kati ya chembe kwenye giligili, na hivyo kupendekeza kwamba nguvu ya uga wa sumaku na umbali kati ya sumaku na eneo lengwa haipaswi kuja kama mshangao.muhimu.Matokeo haya pia yanaonyesha kuwa ingawa sumaku zinaweza kunasa chembechembe ndogo nyingi zinazotiririka kupitia eneo lengwa, kuna uwezekano kwamba sumaku zinaweza kutegemewa kusogeza chembe za CombiMag kwenye uso wa trachea.Kwa hivyo, tulihitimisha kuwa katika vivo tafiti za LV MF zinapaswa kutumia sehemu za sumaku tuli kulenga maeneo mahususi ya mti wa njia ya hewa.
Mara chembe hizo zinapotolewa ndani ya mwili, ni vigumu kuzitambua katika muktadha wa tishu tata zinazosonga za mwili, lakini uwezo wao wa kugundua umeboreshwa kwa kusogeza sumaku kwa usawa juu ya trachea ili "kuzungusha" kamba za Mbunge.Ingawa upigaji picha wa wakati halisi unawezekana, ni rahisi kutambua mwendo wa chembe baada ya mnyama kuuawa kibinadamu.Viwango vya wabunge kwa kawaida vilikuwa vya juu zaidi katika eneo hili wakati sumaku ilipowekwa juu ya eneo la picha, ingawa baadhi ya chembe kwa kawaida zilipatikana chini ya trachea.Tofauti na masomo ya vitro, chembe haziwezi kuvutwa chini ya trachea na harakati ya sumaku.Ugunduzi huu unapatana na jinsi ute unaofunika uso wa mirija kwa kawaida huchakata chembe zilizovutwa, kuzinasa kwenye ute na kisha kuziondoa kupitia utaratibu wa uondoaji wa muco-ciliary.
Tulidhania kwamba kutumia sumaku juu na chini ya trachea kwa kuvutia (Mchoro 3b) kunaweza kusababisha uga sare zaidi wa sumaku, badala ya uga wa sumaku ambao umekolezwa sana katika hatua moja, uwezekano wa kusababisha usambazaji sare zaidi wa chembe..Walakini, utafiti wetu wa awali haukupata ushahidi wazi wa kuunga mkono nadharia hii.Vile vile, kuweka jozi ya sumaku kurudisha nyuma (Mchoro 3c) haukusababisha chembe zaidi kutulia katika eneo la picha.Matokeo haya mawili yanaonyesha kuwa usanidi wa sumaku-mbili hauboreshi kwa kiasi kikubwa udhibiti wa ndani wa uelekezaji wa Mbunge, na kwamba matokeo ya kani kali za sumaku ni vigumu kusawazisha, na kufanya mbinu hii isifanye kazi.Vile vile, kuelekeza sumaku juu na kwenye trachea (Kielelezo 3d) pia hakuongeza idadi ya chembe zilizobaki katika eneo la picha.Baadhi ya usanidi huu mbadala huenda usifaulu kwani husababisha kupunguzwa kwa uga wa sumaku katika eneo la uwekaji.Kwa hivyo, usanidi wa sumaku moja kwa digrii 30 (Kielelezo 3a) inachukuliwa kuwa rahisi na yenye ufanisi zaidi katika njia ya kupima vivo.
Utafiti wa LV-MP ulionyesha kuwa vekta za LV zilipounganishwa na CombiMag na kutolewa baada ya kusumbuliwa kimwili mbele ya uwanja wa sumaku, viwango vya upitishaji viliongezeka sana kwenye trachea ikilinganishwa na vidhibiti.Kulingana na tafiti za picha za synchrotron na matokeo ya LacZ, uga wa sumaku ulionekana kuwa na uwezo wa kuweka LV kwenye trachea na kupunguza idadi ya chembe za vekta ambazo zilipenya mara moja ndani ya pafu.Uboreshaji kama huo wa kulenga unaweza kusababisha ufanisi wa juu huku ukipunguza vyeo vilivyowasilishwa, upitishaji usiolengwa, athari za uchochezi na kinga, na gharama za kuhamisha jeni.Muhimu zaidi, kulingana na mtengenezaji, CombiMag inaweza kutumika pamoja na njia nyingine za uhamisho wa jeni, ikiwa ni pamoja na vekta nyingine za virusi (kama vile AAV) na asidi nucleic.