Giardia duodenum ni kiumbe cha vimelea ambacho husababisha giardiasis, maambukizi ya matumbo ya kawaida kwa watoto wadogo wenye dalili za kliniki za kuhara.Hapo awali tumeripoti kuwa G. duodenalis ya ziada huchochea uanzishaji wa kipokezi kinachofunga cha 3 (NLRP3) cha oligomerization-kama 3 (NLRP3) na kudhibiti majibu ya uchochezi ya mwenyeji kupitia usiri wa vesicle ya ziada (EV).Hata hivyo, mifumo halisi ya molekuli ya duodenococcal EV (GEV) inayohusishwa na pathojeni inayohusika katika mchakato huu na jukumu la inflammasome ya NLRP3 katika giardiasis bado haijafafanuliwa.
plasmids recombinant yukariyoti pcDNA3.1(+)-alpha-2 na alpha-7.3 giardins katika GEV zilijengwa, kuhamishwa katika macrophages msingi panya peritoneal, na kutambuliwa kwa kupima kuvimba molekuli caspase-1.Kiwango cha usemi cha p20 kilikaguliwa..G. duodenalis alpha-2 na alpha-7.3 giardines awali zilitambuliwa kwa kupima NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 na caspase-1 p20), IL secretion.Viwango vya 1β, viwango vya oligomerization ya protini ya apoptotic (ASC), na ujanibishaji wa immunofluorescent wa NLRP3 na ASC.Jukumu la inflammasome ya NLRP3 katika pathogenicity ya G. duodenalis kisha ilipimwa kwa kutumia panya ambazo uanzishaji wa NLRP3 ulizuiwa (panya zilizozuiwa za NLRP3) na mabadiliko ya pathological katika uzito wa mwili, mzigo wa vimelea wa duodenal, na tishu za duodenal zilifuatiliwa.Zaidi ya hayo, tulichunguza ikiwa hiardines alpha-2 na alpha-7.3 huzalisha ute wa IL-1β katika vivo kupitia inflammasome ya NLRP3 na kubaini dhima ya molekuli hizi katika pathogenicity ya G. duodenalis katika panya.
Alpha-2 na alpha-7.3 giardines hushawishi uanzishaji wa NLRP3 inflammasome in vitro.Hii ilisababisha uanzishaji wa p20 caspase-1, ongezeko la viwango vya kujieleza vya NLRP3, pro-IL-1β, na pro-caspase-1 protini, ongezeko kubwa la usiri wa IL-1β, uundaji wa matangazo ya ASA katika saitoplazimu, na kuanzishwa kwa oligomerization ya ASA.Kuvimba kwa NLRP3 Kupoteza uume huongeza pathogenicity ya G. duodenalis katika panya.Panya waliotibiwa na uvimbe kwa kutumia gavage kutoka kwa panya waliozuiwa na NLRP3 walionyesha ongezeko la idadi ya trophozoiti na uharibifu mkubwa kwa duodenal villi, unaojulikana na crypts ya necrotic na shrunken na matawi.Majaribio ya vivo yameonyesha kuwa giardines alpha-2 na alpha-7.3 inaweza kusababisha usiri wa IL-1β kupitia inflammasome ya NLRP3, na chanjo ya giardines alpha-2 na alpha-7.3 ilipunguza pathogenicity ya G. duodenalis katika panya.
Kwa pamoja, matokeo ya utafiti huu yanaonyesha kuwa giardia alpha-2 na alpha-7.3 husababisha udhibiti wa kuvimba kwa NLRP3 na kupunguza maambukizi ya G. duodenalis katika panya, ambayo ni malengo ya kuahidi ya kuzuia giardiasis.
Giardia duodenum ni vimelea vya protozoa vya nje ya seli ambavyo huishi kwenye utumbo mwembamba na husababisha visa milioni 280 vya giardiasis na kuhara kila mwaka, haswa miongoni mwa watoto wadogo katika nchi zinazoendelea [1].Watu huambukizwa na maji ya kunywa au chakula kilichochafuliwa na cysts ya M. duodenum, ambayo huingia ndani ya tumbo na hutolewa kwenye juisi ya tumbo.Giardia duodenum trophozoites hushikamana na epithelium ya duodenal, na kusababisha kichefuchefu, kutapika, kuhara, maumivu ya tumbo, na kupoteza uzito.Watu walio na immunodeficiency na cystic fibrosis wanahusika na maambukizi.Maambukizi yanaweza pia kutokea kupitia ngono ya mdomo na mkundu [2].Madawa ya kulevya kama vile metronidazole, tinidazole, na nitazoxanide ndizo njia bora zaidi za matibabu ya maambukizo ya duodenal [3].Walakini, dawa hizi za chemotherapy husababisha athari mbaya kama vile kichefuchefu, saratani, na sumu ya jeni [4].Kwa hiyo, mikakati madhubuti zaidi inahitaji kutengenezwa ili kuzuia maambukizi ya G. duodenalis.
Inflammasomes ni kundi la tata za protini za cytosolic ambazo ni sehemu ya mwitikio wa ndani wa kinga, kusaidia kulinda dhidi ya uvamizi wa pathojeni na kupatanisha majibu ya uchochezi [5].Miongoni mwa hizi inflammasomes, nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-kama inflammasome imechunguzwa kwa kina kwa sababu inaweza kugunduliwa na mifumo mbalimbali ya molekuli ya pathojeni/uharibifu/ DAMP), hutambua, huamsha mfumo wa kinga ya ndani.na inasimamia homeostasis ya matumbo katika magonjwa mengi ya uchochezi [6,7,8].Inajumuisha kipokezi cha utambuzi wa muundo (PRR) NLRP3, protini yenye madoadoa ya apoptotiki (ASC), na athari ya procaspase-1 au procaspase-11.Inflammasome ya NLRP3 hufanya kazi kama mwenyeji dhidi ya uvamizi wa pathojeni, kama inavyoonekana katika Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], na tafiti za Leishmania.[11], lakini pia imeripotiwa kuwa uanzishaji wa NLRP3 inflammasome hupunguza mwitikio wa kinga ya kinga na huongeza kasi ya ugonjwa, kwa mfano, katika minyoo [12].Kulingana na matokeo yetu ya awali, tuliripoti kwamba extracellular G. duodenalis huchochea uanzishaji wa intracellular wa kuvimba kwa NLRP3 na kurekebisha majibu ya uchochezi ya mwenyeji kwa kutoa vesicles ya ziada ya seli (EVs) [13].Hata hivyo, jukumu la inflammasome ya NLRP3 katika maambukizi ya G. duodenalis katika vivo inabakia kuamua.
Giardins awali zilielezewa kama vipengele vya miundo ya G. duodenalis cytoskeleton na ina jukumu muhimu katika motility ya trophozoite na kiambatisho cha seli ya epithelial kwenye utumbo mdogo.Ili kukabiliana vyema na mazingira na kuongeza pathogenicity yao, G. duodenalis trophozoiti ilitengeneza muundo wa kipekee wa cytoskeletal unaojumuisha 8 flagella, 1 mwili wa kati, na 1 ventral disc [14].Trophozoiti za Giardia duodenum hutumia cytoskeleton yao kupenya utumbo mdogo wa juu, hasa duodenum, na kushikamana na enterocytes.Wao huhama mara kwa mara na kushikamana na seli za epithelial kwa kutumia kimetaboliki ya seli.Kwa hiyo, kuna uhusiano wa karibu kati ya cytoskeleton yao na virulence.Giardines maalum kwa Giardia duodenum ni vipengele vya muundo wa cytoskeleton [15] na imegawanywa katika makundi manne: α-, β-, γ-, na δ-giardines.Kuna watu 21 wa familia ya α-giardin, ambao wote wana uwezo unaotegemea kalsiamu wa kuunganisha phospholipids [16].Pia huunganisha cytoskeleton kwenye membrane ya seli.Kwa watu walio na ugonjwa wa kuhara unaosababishwa na G. duodenalis, α-giardins huonyeshwa sana na huzuia kinga wakati wa maambukizi [17].Chanjo za Heterologous kulingana na Giardia alfa-1 zinazolindwa dhidi ya giardiasis katika panya na ni antijeni zinazowezekana kwa utengenezaji wa chanjo [18].Alpha-8 giardin, iliyowekwa ndani ya utando wa plasma na flagella, lakini si katika diski ya tumbo, huongeza mwendo na kasi ya ukuaji wa trophozoiti katika G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin inashikamana na miundo midogo midogo kwenye flagella na kuathiri uwezo wa G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine inapatikana kwa wingi katika mzunguko wa maisha, na kujieleza kupita kiasi kwa alpha-11 giardine huharibu G. duodenalis yenyewe [21].Hata hivyo, haijulikani ikiwa alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine ni kinga dhidi ya maambukizi ya G. duodenalis na taratibu zao za msingi.
Katika utafiti huu, recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine zilipitishwa kwenye macrophages ya msingi ya panya ya peritoneal ili kuamilisha mwenyeji NLRP3.Malengo ya uchochezi yalikaguliwa.Pia tulitathmini dhima ya NLRP3 inflammasome katika pathogenicity ya G. duodenalis, tukachunguza kama alpha-2 na alpha-7,3 giardines hushawishi kuwezesha NLRP3 inflammasome katika vivo, na tukaamua kuwa majukumu haya mawili ya giardines katika pathogenicity ya. G. duodenalis.Lengo letu la pamoja lilikuwa kuunda malengo ya kuahidi ya kuzuia maambukizi ya G. duodenalis.
Aina ya pori (WT) C57BL/6 panya wa kike wenye umri wa wiki 5-8 walinunuliwa kutoka Kituo cha Majaribio cha Wanyama cha Liaoning Changsheng (Liaoning, Uchina).Panya walipata maji bila malipo, walipokea chakula cha kuzaa na waliwekwa katika mzunguko wa saa 12/12 wa mwanga/giza.Kabla ya kuambukizwa, panya walipokea antibiotics ad libitum katika maji ya kunywa yaliyoongezwa ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), na neomycin (1.4 mg/mL) (zote zilinunuliwa kutoka Shanghai, Uchina, viumbe bandia) [22 ].].Panya waliopoteza uwezo wa kula na kunywa kwa zaidi ya saa 24 na kupoteza ≥ 20% ya uzani wa mwili waliumizwa kibinadamu kwa kuteguka kwa seviksi.
WB G. duodenalis trophozoites (Mkusanyiko wa Utamaduni wa Aina ya Amerika, Manassas, USA) iliongezewa na 12.5% ​​ya seramu ya fetasi ya ng'ombe (FBS; Every Green, Zhejiang, China) na 0.1% nyongo ya bovine (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA )USA) chini ya hali ya microaerobic.Trophozoiti zilizounganishwa zilikusanywa kwenye barafu na kupitishwa kwa uwiano wa 1: 4 kwa uzazi zaidi.
Vivimbe vya giardia duodenum vilichochewa kama ilivyoelezwa hapo awali [23], trophozoiti zilivunwa katika awamu ya logarithmic na kisha kupunguzwa kwa njia ya kupenyeza, pH 7.1 (iliyorekebishwa TYI-S-33) hadi mkusanyiko wa mwisho wa 1 × 106 trophozoiti/mL.mkusanyiko wa bile 0.05% kati).Trophozoiti zilikuzwa chini ya hali ya anaerobic saa 37°C hadi awamu ya ukuaji wa logarithmic.Badilisha kati ya cyst inducing kati (pH 7.8; iliyorekebishwa TYI-S-33 kati na 1% mkusanyiko wa bile) na utamaduni G. duodenalis saa 37 ° C kwa masaa 48-96, wakati ambapo malezi ya cysts yalizingatiwa chini ya darubini.Baada ya trophozoiti nyingi kushawishiwa kuunda cysts, mchanganyiko wa kitamaduni ulivunwa na kusimamishwa tena katika maji ya deionized tasa ili lyse trophozoiti iliyobaki.Cysts zilihesabiwa na kuhifadhiwa kwa 4°C kwa uchambuzi uliofuata kupitia mrija wa tumbo kwenye panya.
Giardia vilengelenge vya ziada vya seli (GEVs) viliboreshwa kama ilivyoelezwa hapo awali [13].Trophozoiti katika awamu ya ukuaji wa logarithmic zilisimamishwa tena kwa njia iliyorekebishwa ya TYI-S-33 iliyotayarishwa na FBS iliyopungua exosome (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) hadi mkusanyiko wa mwisho wa 1 × 106 vimelea/mL na kuingizwa kwa saa 12.walikuwa wametengwa na utamaduni supernatant kwa centrifugation katika 2000 g kwa dakika 10, 10,000 g kwa dakika 45, na 100,000 g kwa 60 min.Mvua iliyeyushwa katika salini iliyobanwa ya fosfati (PBS), ilikaguliwa kwa kutumia kifaa cha kupima protini cha BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) na kuhifadhiwa kwa -80° C. au kutumika moja kwa moja kwa uchanganuzi zaidi.
Macrophages ya msingi ya peritoneal ya panya ilitayarishwa kama ilivyoelezwa hapo awali [24].Kwa ufupi, panya (wenye umri wa wiki 6-8) walidungwa (intraperitoneally [ip]) na 2.5 ml ya 2.98% Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) na kulishwa palate 3-4.Kusimamishwa kwa macrophages ilikusanywa kutoka kwa panya ya tumbo ya panya baada ya euthanasia na kuingizwa mara 3 kwa 1000 g kwa dakika 10.Seli zilizovunwa ziligunduliwa kwa saitometi ya mtiririko kwa kutumia alama ya CD11b hadi usafi wa seli ulikuwa >98%, kisha kuongezwa kwa sahani za uundaji wa seli zenye visima 6 (seli 4.5 x 106/kisimani) na kuangaziwa kwa 10% FBS (Bioindustry) katika 37°C.na 5% CO2.
RNA ilitolewa kutoka kwa trophozoiti 1 × 107 katika ml 1 ya kitendanishi cha TRIzol (Vazyme, Nanjing, Uchina), DNA ya genomic ilitolewa kutoka kwa jumla ya G. duodenalis RNA kwa kutumia MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) na DNA ya ziada (cDNA) iliundwa. kwa kutumia MonScript RTIIII Super Mix (Monad) kulingana na maagizo ya mtengenezaji.
Taarifa za mfuatano wa CDS kwa jeni lengwa la G. duodenalis zilipatikana kutoka kwa NCBI GenBank.Tumia Primer 5.0 ili kuunda vianzio mahususi vya uundaji wa mshono kwa kila jeni lengwa.Kitangulizi cha mbele (5′-3′) kinajumuisha sehemu tatu: mfuatano unaopishana na vekta ya mstari pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) na kodoni za kuanzisha ATG na GNN (ikiwa msingi wa kwanza si G).Hii inafanywa ili kuboresha ufanisi wa usemi.Kwa kuongeza, angalau besi 16 za bp zilizounganishwa (maudhui ya GC 40-60%/Tm takriban 55 °C).Kitangulizi cha nyuma (5′-3′) kinajumuisha sehemu mbili, mfuatano unaopishana na pcDNA3.1(+) ya vekta ya EcoRV-linearized (GCCGCCACTGTGCTGGAT) na msingi uliounganishwa wa angalau 16 bp.(ukiondoa vituo viwili vya mwisho).bases) kodoni kama vile AA au GA kuruhusu plasmidi recombinant kueleza protini zao zilizo na lebo).Mifuatano ya awali imeorodheshwa katika Jedwali la 1 na iliunganishwa na Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Malengo yalikuzwa kwa kutumia Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) au Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) kwa kutumia G. duodenalis cDNA iliyotayarishwa kama kiolezo.Vekta ya usemi wa yukariyoti plasmid pcDNA3.1(+) iliwekwa mstari na kimeng'enya cha kizuizi cha EcoRV na kusafishwa kwa hewa kwa kutumia Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Vipande vya pcDNA3.1(+) vilivyo na mstari na vipande vya jeni lengwa vilivyoimarishwa vilisafishwa kwa kutumia kisanduku cha kusafisha jeli ya DNA (Tiangen) na kukaguliwa kwa kutumia Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Kipande cha pcDNA3.1(+) na kila kipande cha jeni lengwa viliunganishwa upya kwa kutumia mchanganyiko wa kutengeneza mkusanyiko mmoja wa MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) na kuthibitishwa na mpangilio wa DNA kwa kutumia Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) ..
Plasmidi zisizo na Endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 zilitolewa kwa kutumia Plasmid Mini Kit isiyo na SanPrep Endotoxin (Sangon Biotech).Mkusanyiko ulidumishwa zaidi ya 500 ng/µl ili kuhakikisha kuwa EDTA katika bafa ya elution haiingiliani na jaribio la uhamishaji.Macrophages ya peritoneal ya panya ya msingi yalipandwa katika sahani 6-visima na RPMI 1640 kamili ya kati (Biological Industries) kwa saa 12, kisha seli zilioshwa mara 3 katika PBS ya joto ili kuondoa penicillin na streptomycin, na kisha kwa kati kuongezwa na kati kamili.plasmidi zisizo na endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) zilipunguzwa katika 125 μl ya Opti-MEM iliyopunguzwa kati ya seramu (Gibco, Thermo Fisher Scientific) ..Kisha 5 µl ya kitendanishi cha maambukizi ya Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ilipunguzwa katika 125 µl ya serum ya chini ya kati ya Opti-MEM.Tayarisha mchanganyiko wa liposome-DNA kwa kuchanganya plasmid iliyochanganywa isiyo na endotoxin na Lipofectamine 2000 na kuruhusu mchanganyiko kusimama kwenye joto la kawaida kwa dakika 5.Kuhamisha complexes tofauti kwa seli katika kila kisima na kuchanganya polepole.Baada ya masaa 4, njia ya utamaduni wa seli ilibadilishwa na 2 ml ya RPMI 1640 kamili ya kati na utamaduni uliendelea kwa masaa 24.Njia mpya ya kukuza seli iliongezwa kwenye seli na kuingizwa kwa vipindi tofauti kulingana na muundo wa majaribio.
Sampuli za protini kutoka kwa supernatants na seli za seli zilitayarishwa kama ilivyoelezwa hapo awali [25].Vigezo vya uhamisho wa utando kwa pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, na His-tag vilikuwa 200 mA/90 min.Kwa interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) na NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) na 1:5000 ikilenga lebo Yake ( Amylet Scientific, Wuhan, Uchina) na β-actin (Proteintech, Wuhan, Uchina).
Kuunganisha kwa msalaba na disuccinimide subrate (DSS) kulifanyika kama ilivyoelezwa hapo awali [26].Seli zilioshwa mara 3 kwa kutumia PBS baridi na kulazwa kwa sindano ya geji 27 katika 50 µl ASC bafa ya majibu (pH 8.0) iliyo na 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mm HEPES na 125 mM NaHCO3.Mchanganyiko huo ulitiwa centrifuged kwa 5000 g kwa dakika 3 na pellet ilikuwa sutured na 10 µl DSS (25 mM katika DMSO) na 40 µl ASC mmenyuko bafa kwa dakika 30 katika 37°C.Baada ya kuweka katikati kwa 5000 g kwa dakika 10, pellet iliyeyushwa katika suluhisho la 40 µl ya bafa ya mmenyuko ya ASC na 10 µl ya bafa ya 6x ya upakiaji wa protini (TransGen, Beijing, Uchina), na kisha suluhisho ilizimwa kwa joto la kawaida kwa 15. min., Kisha chemsha kwa dakika 10.Sampuli za protini kisha zilikabiliwa na ukaushaji wa Magharibi kwa kutumia kingamwili za msingi za ASC (Wanleibio, Shenyang, Uchina) kwa uwiano wa dilution wa 1:500.
Kufuatia utaratibu uliofafanuliwa hapo awali [13], viambata vya juu vya tamaduni za seli vilivunwa na utolewaji wa sitokine IL-1β iliyokuwa na uchochezi iliamuliwa kwa kutumia kipanya IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Badilisha thamani za OD450nm kuwa viwango vya protini kwa kutumia mkunjo wa kawaida wa IL-1β.
Seli zilizopakwa kwenye vifuniko zilioshwa kwa upole mara 3 kwenye PBS yenye joto, na kuwekwa kwenye kirekebishaji chembechembe za tishu (Biosharp, Beijing, Uchina) kwa dakika 10 kwa joto la kawaida (RT), katika 0.1% Triton X-Permeabilize kwa 100 (iliyopunguzwa katika PBS; Biosharp ) kwa dakika 20 kwa joto la kawaida na kuzuia katika 5% ya albin ya serum ya bovin (katika PBS) kwa saa 2 kwa joto la kawaida.Seli ziliwekwa ndani usiku kucha kwa 4°C na kingamwili za msingi dhidi ya ASC (1:100 dilution) au NLRP3 (1:100 dilution), mtawalia, na mbuzi Cy3 iliyoandikwa anti-sungura IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, USA) au mbuzi aliyeunganishwa na FITC dhidi ya panya IgG (1:400; Earthox) mara moja kwa 37°C gizani kwa saa 1.Viini vilitiwa madoa na Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Uchina) kwa dakika 5 na kuzingatiwa chini ya darubini ya umeme (Shirika la Olympus, Tokyo, Japan).
Panya waligawanywa katika vikundi vinne (n = 7 katika kila kikundi): (i) Kikundi cha udhibiti hasi kilichotibiwa na PBS (PBS pekee; gavage 100 µl/panya PBS ikifuatiwa na sindano ya kila siku ya intraperitoneal 100 µl/panya PBS saa 3 baadaye) ., mfululizo kwa siku 7);(ii) kikundi cha udhibiti hasi kilichotibiwa kwa kiviza cha MCC950 [27] (100 µl/panya kupitia gavage ya PBS, saa 3 baadaye, 10 mg/kg uzito wa mwili [BW] MCC950 [katika PBS] ilisimamiwa ndani ya mshipa kila siku, muda wa siku 7);(iii) Kikundi cha maambukizi ya cyst ya G. duodenalis (1.5 x 106 cysts/panya by gavage, saa 3 baadaye, 100 μl/panya PBS intraperitoneally kusimamiwa kila siku kwa siku 7);(iv) G. duodenalis cyst pamoja maambukizi kundi MCC950 inhibitor matibabu kundi (1.5×106 cysts/panya kupitia gavage, 10mg/kg uzito wa mwili MCC950 intraperitoneally kila siku kwa siku 7 saa 3h).Uzito wa mwili wa kila panya ulifuatiliwa kila siku na panya wote waliadhibiwa siku ya 7.Duodenum iliyovunwa (urefu wa cm 3) ilikatwa vipande vidogo katika 1 ml PBS, cysts ziliharibiwa usiku mmoja katika PBS saa 4 ° C, na G. duodenalis trophozoites.Duodenum safi (urefu wa sentimeta 1) ilitengwa kwa ajili ya uchafu wa hematoksilini na eosini (H&E).
Panya waligawanywa katika vikundi viwili: (i) Kikundi cha kudhibiti MOCK na (ii) Kikundi cha vizuizi cha MCC950.Kulikuwa na matibabu matano katika kila kundi (n = 7/kikundi cha matibabu): (i) Kikundi cha udhibiti hasi cha matibabu ya PBS (PBS pekee; 100 µl/panya PBS, sindano ya ndani ya misuli (IM) (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) kikundi cha udhibiti hasi cha plasmid (100 µg/DNA ya panya, kupitia sindano ya ndani ya misuli) (iii) Kikundi cha kudhibiti maambukizi ya cyst ya duodenalis (1.5 x 106 cysts/panya, kupitia gavage) (iv) a kundi lililotibiwa kwa plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/DNA ya kipanya, kwa kudungwa ndani ya misuli), na (v) kikundi kilichotibiwa kwa plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/panya DNA, baada ya masaa 12 ya kupita, panya katika kundi la vizuizi vya MCC950 walipokea sindano ya kila siku ya ndani ya peritoneal ya MCC950 (10 mg/kg uzito wa mwili) kwa siku 7, wakati panya katika kundi la MOCK walipokea kiasi sawa cha matibabu ya PBS. Sampuli za damu zilikuwa zilizokusanywa kutoka kwa panya wa mboni za macho na kushoto mara moja kwa 4 ° C Sampuli za Serum zilitengwa kwa kutumia enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kwa na vipimo vya IL-1β.
Panya thelathini na tano waligawanywa katika vikundi vitano (n=7/kikundi).Kikundi cha 1 kilikuwa kikundi cha udhibiti hasi kilichotibiwa na PBS: panya walipokea 100 μl ya PBS intramuscularly na siku 3 baadaye kwa gavage.Kikundi cha 2 ni kikundi cha udhibiti chanya kilichoambukizwa na cysts za G. duodenalis: panya walidungwa 100 μl ya PBS, na siku 3 baadaye 1.5 x 106 cysts / panya walikuwa hudungwa intragastric.Kikundi cha tatu - chanjo ya plasmid na pcDNA3.1 (+) pamoja na kikundi cha kudhibiti maambukizi ya cyst ya duodenal: panya walipokea 100 μg ya plasmid DNA pcDNA3.1 (+) (im) kwa mdomo, 1.5 × 106 cysts / panya 3 kwa kadhaa siku.Vikundi 4 na 5 vilikuwa pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid au pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid pamoja na maambukizi ya G. duodenalis cyst.Kikundi cha majaribio: panya walipokea 100 µg ya pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), kisha siku 3 baadaye, 1.5 × 106 cysts/panya zilidungwa kupitia gavage.Uzito wa mwili wa kila panya ulifuatiliwa baada ya kuanzishwa kwa cyst ya G. duodenalis kupitia bomba.Duodenum safi ilikusanywa kwa vipimo vya mzigo wa vimelea na uchambuzi wa uchafu wa HE.
Mabadiliko ya kihistoria yalichambuliwa kulingana na utaratibu uliochapishwa hapo awali [30].Duodenum safi iliwekwa kwa kurekebisha seli za tishu, kupachikwa kwenye mafuta ya taa, kukatwa katika sehemu za 4 μm, kuchafuliwa na H&E na kuchambuliwa chini ya darubini nyepesi.Mwakilishi wa mabadiliko ya pathological katika sehemu saba za tishu kutoka kwa panya saba za kujitegemea zilitathminiwa na mwanapatholojia asiyejua matibabu na zilikamatwa kwa ukuzaji wa 200x.Urefu wa villi na kina cha crypts zilipimwa kwa mujibu wa mbinu zilizoelezwa hapo awali.
Matokeo katika vitro na vivo yalipatikana kwa mara tatu.Grafu zilitolewa kwa kutumia GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Tofauti kati ya vikundi viwili zilichanganuliwa na t-test, ilhali tofauti kati ya vikundi ≥3 zilichanganuliwa kwa uchanganuzi wa njia moja wa tofauti (ANOVA) kwa kutumia programu ya SPSS (toleo la 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) .Data ilichanganuliwa kwa homogeneity ya tofauti kwa kutumia jaribio la Levene likifuatwa na jaribio la post hoc la Bonferroni (B).Umuhimu unaonyeshwa kama P<0.05, P<0.01, na P<0.001 (sio muhimu [ns]) (P>0.05).
Uchambuzi wetu wa awali wa proteomics za GEV katika Encyclopedia ya Kyoto ya Jeni na Genomes (KEGG) ulionyesha kuwa shabaha nyingi zinaweza kuhusishwa katika uanzishaji wa njia za ishara za uchochezi [13].Tulichagua shabaha mbili za kuahidi, alpha-2 na alpha-7.3 giardins, kukuza molekuli hizi na kuzitumia kuunda pcDNA3.1(+) vekta ya usemi wa yukariyoti.Baada ya mpangilio, pcDNA3.1(+)-alpha-2 iliyounganishwa tena na plasmidi za usemi wa alpha-7.3 za giardine zilipitishwa kwenye macrophages ya msingi ya peritoneal ya panya, na protini sahihi ya caspase-1 p20 ya kuvimba (sehemu ya caspase-1 iliyoamilishwa) ilitambuliwa. kama kufafanua molekuli muhimu ambazo zinaweza kusababisha kuvimba.Matokeo yalionyesha kuwa alpha-2 na alpha-7.3 giardines zinaweza kushawishi usemi wa p20 caspase-1 sawa na GEV.Hakuna athari kwa uanzishaji wa caspase-1 iliyopatikana katika udhibiti hasi ambao haujatibiwa (PBS pekee) na udhibiti wa plasmid pcDNA3.1 (+) (Mchoro 1).
Kipimo cha kuwezesha p20 caspase-1 na pcDNA3.1(+)-alpha-2 na alpha-7.3 giardins.Recombinant yukariyoti kujieleza plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 na alpha-7.3 giardines (juu ya kila njia) walikuwa kubadilishwa katika msingi panya macrophages peritoneal na utamaduni supernatants walikuwa kuvuna 24 saa baadaye.Ukaushaji wa Magharibi ulitumiwa kupima viwango vya kujieleza vya sahihi ya protini ya caspase-1 p20 inflammasome.Kikundi cha matibabu cha PBS-pekee (laini C) na kikundi cha pcDNA3.1(+) cha tiba moja cha pcDNA3.1 kilitumika kama udhibiti hasi, na kikundi cha matibabu cha GEV kilitumika kama udhibiti mzuri.Udhihirisho wa protini recombinant ulithibitishwa kwa kugundua lebo ya histidine katika kila protini, na bendi za protini zilizotarajiwa zilikuwa alpha-2 giardine (38.2 kDa) na alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum mishipa ya ziada ya seli, pcDNA3.1(+), vekta ya mstari wa EcoRV, SUP, nguvu kuu
Kuamua kama alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine hushawishi usemi wa p20 caspase-1 na kuchukua jukumu katika kuwezesha mwitikio wa uchochezi wa NLRP3, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine na pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin ilipitishwa katika macrophages ya msingi ya panya ya peritoneal na DNA ya plasmid recombinant, na viwango vya kujieleza, ujanibishaji, na oligomerization ya protini muhimu za uchochezi NLRP3 ziliamuliwa.Katika jaribio hili, GEV ilitumika kama kikundi cha udhibiti chanya, na kikundi kisicho na matibabu (PBS pekee) au kikundi cha matibabu ya maambukizi ya pcDNA3.1(+) kilikuwa kikundi hasi.Matokeo yalionyesha kuwa, kama katika kundi la GEV, DNA ya plasmid recombinant ya giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 na giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ilisababisha kurekebishwa kwa NLRP3, pro-IL-1β na uanzishaji wa procaspase-1 na caspase-1 (Mchoro 2a).Kwa kuongeza, giardines zote mbili zilisababisha usiri mkubwa wa IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 );alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Mchoro 2b).Protini nyingi za ASC zilikuwa za kipekee katika kikundi kisicho na matibabu au katika kikundi cha matibabu kilichopitishwa na pcDNA3.1(+) plasmid, tofauti na pcDNA3.1(+)-alpha-2 au pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.ASC oligomerization ilitokea katika DNA recombinant plasmid ya GEV chanya kudhibiti kundi au kundi, kuonyesha oligomeric fomu (Kielelezo 2c).Data hizi za awali zinaonyesha kuwa alpha-2 giardine na alpha-7,3 giardine zinaweza kushawishi uanzishaji wa kuvimba kwa NLRP3.Uchunguzi uliofuata wa immunofluorescent wa ujanibishaji wa ASC na NLRP3 ulionyesha kuwa katika kikundi cha udhibiti hasi, protini ya ASC ilitawanyika katika saitoplazimu na ilionekana kama ishara ya nukta wakati wa kusisimua kwa pcDNA3.1(+)-alpha-2 na giardine au pcDNA3.1(+)-alpha-7,3 kikundi cha giardine au kikundi cha udhibiti chanya cha GEV (Mchoro 2d).Katika udhibiti hasi na vikundi vya pcDNA 3.1 vilivyotibiwa na plasmid, ishara ya protini ya NLRP3 haikugunduliwa, wakati doti ya ishara ya fluorescent ikijibu pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine au pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 iligunduliwa..giardine hupatikana kwenye cytoplasm au juu ya kusisimua kwa HEV (Mchoro 2e).Data hizi zinaonyesha zaidi kwamba G. duodenalis giardin alpha-2 na giardin alpha-7.3 huwezesha inflammasome ya NLRP3 katika macrophages ya msingi ya peritoneal ya panya.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin huwasha NLRP3 inflammasome katika macrophages ya peritoneal ya panya.Hamisha usemi recombinant yukariyoti plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ndani ya seli kuu ya murine peritoneal, au vuna nguvu kuu ndani ya h 24 kwa uchanganuzi wa kujieleza, oligomerization. , usiri.na ujanibishaji wa protini muhimu za uchochezi.Kikundi cha PBS-pekee (C) na pcDNA3.1(+) kikundi kimoja cha matibabu kilitumika kama udhibiti hasi, na kikundi cha matibabu cha GEV kilitumika kama kikundi chanya.Protini muhimu za uchochezi NLRP3, ikiwa ni pamoja na NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, na p20 caspase-1, ziligunduliwa na uzuiaji wa Magharibi.b Viwango vya secretion ya IL-1β katika supernatants iliamuliwa kwa kutumia enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Tofauti kati ya vikundi vya udhibiti na majaribio vilichanganuliwa kwa uchanganuzi wa njia moja wa tofauti (ANOVA) kwa kutumia programu ya SPSS toleo la 22.0.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya vikundi **P<0.01 na ***P<0.001.c Viwango vya oligomerization vya ASC kwenye pellets viliamuliwa na uchanganuzi wa kuunganisha mtambuka wa DSS, ilhali viwango vya ASC katika seli za seli vilitumika kama udhibiti wa upakiaji.d Taswira ya ujanibishaji wa ISC kwa kutumia immunofluorescence.e Immunofluorescence ilitumika kuibua ujanibishaji wa NLRP3.ASC, protini inayofanana na madoadoa ya apoptotic;IL, interleukin;NLRP3, kipokezi 3 kinachofunga nyukleotidi-kama oligomerization;ns, sio muhimu (P > 0.05)
G. duodenalis na GEV inazozitoa huwasha NLRP3 inflammasome na kudhibiti majibu ya uchochezi ya mwenyeji katika vitro.Kwa hivyo, jukumu la inflammasome ya NLRP3 katika pathogenicity ya G. duodenalis bado haijulikani.Ili kuchunguza suala hili, tulitengeneza jaribio kati ya panya walioambukizwa cyst ya G. duodenalis na panya walioambukizwa na G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor treatment na kulinganisha usemi wa NLRP3 inflammasome walipoambukizwa G. duodenalis cyst.Mpango wa kina wa jaribio unaonyeshwa kwenye Mchoro 3a.Mabadiliko katika uzito wa mwili wa panya katika vikundi tofauti vya matibabu yalifuatiliwa kwa siku 7 baada ya kuambukizwa na cysts, na matokeo yanaonyeshwa kwenye Mchoro 3b.Ikilinganishwa na kundi lililotibiwa na PBS safi, matokeo yalionyesha kwamba (i) uzito wa mwili wa panya walioambukizwa na G. duodenalis cyst ilipungua kutoka siku ya 3 hadi siku ya 7 baada ya kuambukizwa;(ii) matibabu kwa kutumia kizuizi cha MCC950 hayakuwa na athari kubwa kwa uzito wa mwili wa panya..Ikilinganishwa na kundi moja la maambukizi, BW ya kikundi cha maambukizo ya duodenal iliyotibiwa na MCC950 ilipungua hadi digrii tofauti (Siku ya 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Siku ya 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Siku ya 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; Siku ya 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Siku ya 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; Siku ya 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).Data hizi zinaonyesha kwamba inflammasome ya NLRP3 inalinda panya kutokana na kupoteza uzito mkubwa katika hatua za mwanzo (siku 2-4) za maambukizi ya duodenal.Kisha tulilenga kuchunguza G. duodenalis trophozoites katika maji ya lavage ya duodenal na matokeo yanaonyeshwa kwenye Mchoro 3c.Ikilinganishwa na kikundi cha maambukizi ya G. duodenalis cyst, idadi ya trophozoites katika duodenum iliongezeka kwa kiasi kikubwa baada ya kuzuia inflammasome ya NLRP3 (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Tishu za duodenal zilizochafuliwa na HE zilionyesha, ikilinganishwa na udhibiti hasi unaotibiwa na PBS na MCC950 pekee: (i) Maambukizi ya cyst ya G. duodenalis yalisababisha uharibifu wa villi ya duodenal (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488 ) na crypt atrophy (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum kutoka kwa panya walioambukizwa na G. duodenalis cysts na kutibiwa kwa vizuizi vya MCC950.duodenal villi walikuwa kuharibiwa na kufa (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) na atrophy na crypt matawi (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Mchoro 3d- f) .Matokeo haya yanaonyesha kuwa NLRP3 inflammasome ina jukumu katika kupunguza pathogenicity ya G. duodenalis.
Jukumu la NLRP3 inflammasome katika maambukizi ya Giardia duodenum.Panya walitobolewa (iv) na uvimbe wa duodenococcal na kisha kutibiwa na au bila MCC950 (ip).Vikundi vya matibabu moja vilivyo na PBS au MCC950 vilitumika kama vidhibiti.Kikundi cha majaribio na regimen ya matibabu.b Uzito wa mwili wa panya katika kila moja ya vikundi mbalimbali vya matibabu ulifuatiliwa kwa siku 7.Tofauti kati ya kikundi cha maambukizo ya G. duodenalis na kikundi cha matibabu ya maambukizi ya G. duodenalis + MCC950 ilichambuliwa na t-test kwa kutumia programu ya SPSS toleo la 22.0.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika *P<0.05, **P<0.01, au ***P<0.001.c Mzigo wa vimelea uliamua kwa kuhesabu idadi ya trophozoiti katika maji ya lavage ya duodenal.Tofauti kati ya kikundi cha maambukizo ya G. duodenalis na kikundi cha matibabu ya maambukizi ya G. duodenalis + MCC950 ilichambuliwa na t-test kwa kutumia programu ya SPSS toleo la 22.0.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika *P <0.05.d Matokeo ya uchafu wa Hematoksilini na eosini (H&E) ya histopatholojia ya duodenal.Mishale nyekundu inaonyesha uharibifu wa villi, mishale ya kijani inaonyesha uharibifu wa crypts.Upau wa kipimo: 100 µm.e, f Uchambuzi wa takwimu wa urefu wa duodenal villus na urefu wa siri ya panya.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika *P<0.05 na **P<0.01.Matokeo yanachukuliwa kutoka kwa majaribio 7 huru ya kibaolojia.BW, uzito wa mwili;ig, njia ya utoaji wa intragastric;ip, njia ya utoaji wa intraperitoneal;ns, sio muhimu (P > 0.05);PBS, phosphate buffered saline;WT, aina ya mwitu
Siri ya IL-1β ni sifa ya uanzishaji wa kuvimba.Ili kubaini kama G. duodenalis alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine huwasha kipangishi cha NLRP3 inflammasome katika vivo, tulitumia panya wa WT ambao hawajatibiwa (kikundi cha sham) na panya waliozuiwa na kuvimba kwa uvimbe wa NLRP3 (kikundi cha matibabu kilichozuiwa na MCC950).Mpango wa kina wa jaribio unaonyeshwa kwenye Mchoro 4a.Vikundi vya majaribio vilijumuisha panya waliotibiwa kwa PBS, G. duodenalis cyst treatment by gavage, intramuscular injection ya pcDNA3.1, na intramuscular injection ya pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine au pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Siku ya 7 baada ya utawala wa intramuscular wa plasmid recombinant, seramu ilikusanywa na kiwango cha IL-1β katika kila kikundi kiliamuliwa.Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 4b, katika kikundi cha MOCK: (i) ikilinganishwa na kikundi cha PBS, matibabu ya pcDNA3.1 hayakuwa na athari kubwa kwenye usiri wa IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), hata hivyo, Usiri wa IL-β uliinuliwa kwa kiasi kikubwa katika kikundi cha G. duodenalis cyst (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine na pcDNA3.1- Sindano ya intramuscular ya alpha-7.3 giardine iliongezeka kwa kiasi kikubwa viwango vya serum IL-1β (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine ilisababisha viwango vya juu vya usiri wa IL -1β katika pcDNA3.1-alpha-2 kikundi cha sindano ya giardine ndani ya misuli (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Ikilinganishwa na kila kikundi katika kikundi cha matibabu cha MCC950 na kikundi cha MOCK: (i) viwango vya usiri wa IL-1β katika kikundi cha kudhibiti PBS na kikundi cha udhibiti cha pcDNA3.1 kilipungua kwa kiwango fulani baada ya kuzuia kizuizi cha MCC950, lakini tofauti haikuwa hivyo. muhimu (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) baada ya kuzuia MCC950., Utoaji wa IL-1β ulipungua kwa kiasi kikubwa katika kundi la G. duodenalis cyst-infected, pcDNA3.1-alpha-2 giardine kundi, na pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine kundi (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: , ANOVA, F ) = 3.540, P = 0.0164).Matokeo haya yanapendekeza kwamba alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine hupatanisha uanzishaji wa NLRP3 inflammasome katika vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines huwasha jeshi la NLRP3 inflammasome katika vivo.Panya walichanjwa (IM) na usemi wa yukariyoti wa plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine au pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine na kisha kutibiwa na MCC950 (ip; kikundi cha MCC950) au la (kikundi dummy )Kikundi cha matibabu cha PBS au pcDNA3.1(+) kilitumika kama udhibiti hasi, kikundi cha matibabu ya cyst ya G. duodenalis kilitumika kama udhibiti mzuri.Kikundi cha majaribio na regimen ya matibabu.b Viwango vya Serum ya IL-1β katika panya vilipimwa siku ya 7 na ELISA assay.Tofauti kati ya vikundi katika kundi la MOCK zilichanganuliwa kwa kutumia ANOVA ya njia moja, na tofauti kati ya kikundi cha MOCK na kikundi cha MCC950 zilichanganuliwa kwa kutumia jaribio la t la toleo la 22.0 la programu ya SPSS.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya vikundi vya matibabu katika kundi la MOCK, *P <0.05 na ***P <0.001;alama za dola ($) zinaonyesha tofauti kubwa kati ya kila kundi katika kundi la MOCK na kundi la MCC950 katika P<0.05.Matokeo ya majaribio saba huru ya kibiolojia.i, sindano ya ndani ya misuli, ns, sio muhimu (P > 0.05)
Ili kuchunguza athari za kuwezesha alpha-2 na alpha-7.3 giardine-mediated ya NLRP3 jeshi inflammasome kwenye G. duodenalis infectivity, tulitumia WT C57BL/6 panya na sindano alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine.plasmid iliingizwa kwa intramuscularly, baada ya siku 3 kupitia tube ya tumbo ya G. duodenalis cyst, baada ya hapo panya zilizingatiwa kwa siku 7.Mpango wa kina wa jaribio unaonyeshwa kwenye Mchoro 5a.Uzito wa mwili wa kila panya ulipimwa kila siku, sampuli za tishu safi za duodenal zilikusanywa siku ya 7 baada ya utawala kupitia bomba la tumbo, idadi ya trophozoiti ilipimwa, na mabadiliko ya histopathological yalizingatiwa.Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro 5b, pamoja na kuongezeka kwa muda wa kulisha, BW ya panya katika kila kundi iliongezeka polepole.MT ya panya ilianza kupungua siku ya 3 baada ya utawala wa intragastric ya G. duodenalis cysts, na kisha kuongezeka kwa hatua kwa hatua.Uanzishaji wa inflammasome ya NLRP3 iliyochochewa na sindano ya ndani ya misuli ya alpha-2 giardine na alpha7.3 giardine ilipunguza kwa kiasi kikubwa kupunguza uzito katika panya (Siku ya 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Siku ya 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Siku ya 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Siku ya 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; Siku ya 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Siku ya 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083; Siku ya 4: pcDNA3.1-alpha-2 , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Siku ya 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Siku ya 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Siku ya 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Siku ya 6. -pcDNA3 alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Siku ya 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Siku ya 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Siku ya 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001).Mzigo wa vimelea ulipimwa katika duodenum (Mchoro 5c).Ikilinganishwa na udhibiti mzuri ambao haujatibiwa na kikundi kilichoingizwa na vekta tupu ya pcDNA3.1, idadi ya G. duodenalis trophozoites ilipunguzwa kwa kiasi kikubwa katika vikundi vilivyodungwa na α-2 giardine na α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Kwa kuongeza, giardine alfa-7.3 ilikuwa kinga zaidi katika panya kuliko giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Matokeo ya uchafuzi wa HE yanaonyeshwa kwenye Mtini.5d–f.Panya waliodungwa kwa alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine walikuwa na vidonda vichache vya tishu za duodenal, vilivyodhihirishwa na uharibifu wa villus, ikilinganishwa na panya waliodungwa na G. duodenalis na panya waliodungwa G. duodenalis pamoja na pcDNA3 vekta tupu .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardini: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 au P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 au P = 0.0055) na atrophy iliyopunguzwa ya crypt (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 au P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 au P = 0.0191).Matokeo haya yanapendekeza kwamba alpha-2 giardine na alpha-7,3 giardine hupunguza uambukizo wa G. duodenalis kwa kuwezesha NLRP3 inflammasome katika vivo.
Jukumu la pcDNA3.1 (+)-giardins katika maambukizi ya G. duodenalis.Panya walichanjwa (IM) na plasmids ya usemi wa yukariyoti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine au pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine kisha wakakabiliwa na uvimbe wa G. duodenalis (ig).Kikundi cha PBS na kikundi cha pcDNA3.1(+) + cha matibabu ya cyst ya duodenal kilitumika kama vikundi vya udhibiti hasi, na kikundi cha matibabu ya cyst ya duodenal kilitumika kama kikundi cha kudhibiti.Kikundi cha majaribio na regimen ya matibabu.b The MT ya panya katika kila moja ya vikundi mbalimbali vya matibabu ilifuatiliwa kwa siku 7 baada ya changamoto.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa kati ya vikundi katika kundi la G. duodenalis na pcDNA3.1(+)-alpha-2 kundi la giardine, *P <0.05, **P <0.01, na ***P <0.001;ishara ya dola ($) inaonyesha tofauti kubwa kati ya kila kundi la G. duodenalis na pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine kundi, $$P<0.01 na $$$P<0.001.c Mzigo wa vimelea uliamuliwa kwa kuhesabu idadi ya trophozoiti katika 1 ml ya uoshaji wa duodenal kutoka kwa duodenum (urefu wa 3 cm) na kuonyeshwa kama idadi ya vimelea kwa cm ya duodenum.Tofauti kati ya kikundi cha maambukizi ya G. duodenalis, pcDNA3.1(+)-alpha-2 kikundi cha giardine, na kikundi cha pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine kilichanganuliwa na ANOVA ya njia moja kwa kutumia toleo la 22.0 la programu ya SPSS.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika **P<0.01 na ***P<0.001.d Mabadiliko ya kihistoria katika duodenum.Mishale nyekundu inaonyesha uharibifu wa villi, mishale ya kijani inaonyesha uharibifu wa crypts.Upau wa kipimo: 100 µm.e, f Uchambuzi wa takwimu wa urefu wa duodenal ya panya (e) na urefu wa siri (f).Tofauti kati ya vikundi kwenye Kielelezo 1d zilichanganuliwa na ANOVA ya njia moja kwa kutumia toleo la programu ya SPSS 22.0.Nyota zinaonyesha tofauti kubwa katika *P<0.05 na **P<0.01.Matokeo ya majaribio saba huru ya kibiolojia.ns, sio muhimu (P > 0.05)
Giardia duodenum ni vimelea vya matumbo vinavyojulikana sana vya wanadamu na mamalia wengine ambao husababisha giardiasis.Mnamo mwaka wa 2004, ilijumuishwa katika Mpango wa Magonjwa Yaliyopuuzwa na WHO kutokana na kuenea kwake kwa zaidi ya miaka 6, hasa katika jamii za hali ya chini ya kijamii na kiuchumi [32].Mfumo wa kinga wa ndani una jukumu muhimu katika mwitikio wa kinga kwa maambukizi ya G. duodenalis.Makrofaji ya panya yameripotiwa kumeza na kuua G. duodenalis kwa kutoa mitego isiyo ya seli [33].Masomo yetu ya awali yameonyesha kuwa G. duodenalis, vimelea vya ziada vya ziada visivyo na uvamizi, huwezesha p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, na NLRP3 njia za ishara za uchochezi katika macrophages ya panya ili kudhibiti majibu ya uchochezi ya mwenyeji, na iliyotolewa GEV inaweza kuimarisha mchakato huu.13], 24].Hata hivyo, PAMPs halisi zinazohusika katika uvimbe unaodhibitiwa na inflammasome katika GEV na dhima ya NLRP3 inflammasome katika giardiasis bado haijafafanuliwa.Ili kuangazia maswali haya mawili, tulifanya utafiti huu.
Inflammasome ya NLRP3 iko kwenye saitoplazimu ya seli za kinga na inaweza kuamilishwa na chembechembe mbalimbali kama vile fuwele za asidi ya mkojo, sumu, bakteria, virusi, na vimelea.Katika tafiti za bakteria, sumu zimetambuliwa kama PAMPs muhimu ambazo huamsha hisi za kuvimba, na kusababisha kuvimba na kifo cha seli [34].Baadhi ya sumu za miundo mbalimbali, kama vile hemolisini kutoka kwa Staphylococcus aureus [35] na Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) kutoka kwa enterotoxin (NHE) [37], huchochea kuwezesha kuvimba kwa NLRP3.Uchunguzi wa virusi umeonyesha kuwa protini zenye virusi kama vile SARS-COV-2 bahasha ya protini (E) [38] na virusi vya Zika NS5 protini [39] ni PAMPs muhimu zinazotambuliwa na kipokezi cha NLRP3.Katika tafiti za vimelea, vimelea vingi vimeripotiwa kuhusishwa na uanzishaji wa inflammasome mwenyeji, kama vile Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], na Leishmania [42].Protini mnene za chembechembe GRA35, GRA42, na GRA43, zinazohusishwa na uhasama wa Toxoplasma gondii, zinahitajika kwa ajili ya kuingiza pyroptosis katika makrofaji ya Lewis panya [43].Kwa kuongeza, baadhi ya tafiti za Leishmania zimezingatia molekuli binafsi zinazohusika katika inflammasome ya NLRP3, kama vile membrane ya vimelea lipophosphoglycan [44] au metalloprotease ya zinki [45].Miongoni mwa familia ya jeni kama annexin-kama alpha-giardin, alpha-1 giardin imeonyeshwa kuwa chanjo inayoweza kutoa kinga dhidi ya G. duodenalis katika modeli ya panya [18].Katika utafiti wetu, tulichagua sababu za G. duodenalis virulence alpha-2 na alpha-7,3 giardines, ambazo ni za kipekee kwa giardia lakini zimeripotiwa kidogo.Jeni hizi mbili zinazolengwa ziliundwa kwenye pcDNA3.1(+) vekta ya mfumo wa usemi wa yukariyoti kwa uchanganuzi wa kuwezesha kuvimba.
Katika modeli yetu ya panya, vipande vya caspase vilivyopasuka hutumika kama viashirio vya kuwezesha uchochezi.Inapochangamshwa, NLRP3 huingiliana na ASC, huajiri prokasi, na hutengeneza kaspasi hai ambazo hupasua pro-IL-1β na pro-IL-18 hadi IL-1β na IL-18 iliyokomaa, mtawalia.Caspases ya kuvimba (caspases-1, -4, -5 na -11) ni familia iliyohifadhiwa ya cysteine ​​​​proteases ambazo ni muhimu kwa ulinzi wa ndani na zinahusika katika kuvimba na kifo cha seli kilichopangwa [46].Caspase-1 huwashwa na inflammasomes za kisheria [47], wakati caspases-4, -5, na -11 hupasuka wakati wa kuunda inflammasomes isiyo ya kawaida [48].Katika utafiti huu, tulitumia macrophages ya peritoneal ya panya kama kielelezo na tukachunguza p20 caspase-1 iliyopasuka caspase-1 kama alama ya uamilisho wa kuvimba kwa NLRP3 katika uchunguzi wa maambukizi ya G. duodenalis.Matokeo yalionyesha kuwa alpha-giardini nyingi zinahusika na uanzishaji wa kawaida wa kuvimba, ambayo inaambatana na ugunduzi wa molekuli muhimu za virulence zinazohusika na bakteria na virusi.Hata hivyo, utafiti wetu ni skrini ya awali tu na kuna molekuli nyingine zinazoweza kuamsha inflammasomes zisizo za kitamaduni, kama vile utafiti wetu wa awali uligundua inflammasomes za asili na zisizo za kitamaduni katika maambukizi ya G. duodenalis [13].Ili kubainisha zaidi ikiwa p20 caspase-1 inayozalishwa inahusishwa na inflammasome ya NLRP3, tulibadilisha giardini za alpha-2 na alpha-7.3 kwenye makrofaji ya peritoneal ya panya ili kubaini viwango muhimu vya kujieleza kwa molekuli ya protini na viwango vya oligomerization vya ASC, na kuthibitisha kuwa α-giardini zote mbili zinawashwa. inflammasome NLRP3.Matokeo yetu ni tofauti kidogo na yale ya Manko-Prykhoda et al., ambao waliripoti kwamba kusisimua kwa seli za Caco-2 na aina za G. muris au E. coli EPEC pekee kunaweza kuongeza nguvu ya fluorescence ya NLRP3, ASC, na caspase-1, ingawa si kwa kiasi kikubwa, wakati jinsi ubadilishanaji wa G. muris na E. koli uliongeza viwango vya protini tatu [49].Tofauti hii inaweza kuwa kutokana na tofauti katika uteuzi wa spishi za Giardia, mistari ya seli, na seli msingi.Pia tulifanya majaribio ya vivo kwa kutumia MCC950 katika panya wa kike wa WT C57BL/6 wa wiki 5, ambao huathirika zaidi na G. duodenalis.MCC950 ni kizuizi chenye nguvu na teule cha molekuli ndogo ya NLRP3 ambayo huzuia uanzishaji wa kisheria na usio wa kisheria wa NLRP3 katika viwango vya nanomolar.MCC950 huzuia kuwezesha NLRP3 lakini haiathiri kuwezesha AIM2, NLRC4, na NLRP1 njia za uchochezi au njia za kuashiria TLR [27].MCC950 huzuia kuwezesha NLRP3 lakini haizuii uanzishaji wa NLRP3, K+ efflux, Ca2+ kufurika, au mwingiliano kati ya NLRP3 na ASC;badala yake, inazuia uanzishaji wa inflammasome ya NLRP3 kwa kuzuia oligomerization ya ASC [27].Kwa hiyo, tulitumia MCC950 katika utafiti wa vivo ili kuamua jukumu la NLRP3 inflammasome baada ya sindano ya giardine.Caspase-1 p10 iliyoamilishwa hupasua saitokini zinazoweza kuwasha uchochezi pro-IL-1β na pro-IL-18 hadi IL-1β na IL-18 iliyokomaa [50].Katika utafiti huu, viwango vya serum IL-1β katika panya waliotibiwa giardine walio na au bila MCC950 vilitumika kama kiashirio cha iwapo NLRP3 inflammasome iliwashwa.Kama ilivyotarajiwa, matibabu ya MCC950 yalipunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya serum IL-1β.Data hizi zinaonyesha wazi kwamba G. duodenalis giardin alfa-2 na giardin alfa-7.3 wanaweza kuwezesha NLRP3 inflammasome ya panya.
Data muhimu iliyokusanywa katika kipindi cha muongo mmoja uliopita imeonyesha kuwa IL-17A ndiyo mdhibiti mkuu wa kinga dhidi ya G. muris, ikichochea utoaji wa IL-17RA, kuzalisha peptidi za antimicrobial, na kudhibiti uanzishaji wa kukamilisha [51].Hata hivyo, maambukizi ya Giardia hutokea mara nyingi zaidi kwa vijana, na imeripotiwa kuwa maambukizi ya Giardia kwa panya wachanga hayawashi jibu la IL-17A ili kutoa athari yake ya kinga [52], na kusababisha watafiti kutafuta Giardia nyingine ya kinga.taratibu za maambukizi ya helminth.Waandishi wa utafiti wa hivi karibuni waliripoti kwamba G. muris inaweza kuamsha inflammasome ya NLRP3 na E. coli EPEC, ambayo inakuza uzalishaji wa peptidi za antimicrobial na kupunguza uwezo wake wa kushikamana na idadi ya trophozoiti katika njia ya utumbo, na hivyo kupunguza ukali wa koloni. magonjwa yanayosababishwa na bacilli [49].Inflammasome ya NLRP3 inahusika katika maendeleo ya magonjwa mbalimbali.Uchunguzi umeonyesha kuwa Pseudomonas aeruginosa huchochea ugonjwa wa autophagy katika macrophages ili kuepuka kifo cha seli, na mchakato huu unategemea kuwezesha NLRP3 inflammasome [53].Kwa N. caninum, uwezeshaji tendaji wa aina ya oksijeni-iliyopatanishwa na inflammasome ya NLRP3 huzuia urudufishaji wake katika seva pangishi, na kuifanya kuwa lengo linalowezekana la matibabu [9].Paracoccidioides brasiliensis imepatikana ili kushawishi uanzishaji wa inflammasome ya NLRP3 katika seli za dendritic zinazotokana na uboho wa panya, na kusababisha kutolewa kwa cytokine ya uchochezi IL-1β, ambayo ina jukumu muhimu katika ulinzi wa mwenyeji [10].Aina kadhaa za Leishmania, ikiwa ni pamoja na L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, na L. infantum chagasi, huwasha NLRP3 na caspase-1 inayotegemea ASC katika macrophages, pamoja na maambukizi ya Leishmania.Uigaji wa vimelea huimarishwa katika upungufu wa panya katika jeni la NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Maambukizi ya Leishmania yameripotiwa kushawishi uanzishaji wa inflammasome ya NLRP3 katika macrophages, ambayo inazuia uzazi wa vimelea vya ndani ya seli.Kwa hivyo, Leishmania inaweza kuzuia kuwezesha NLRP3 kama mkakati wa kuepuka.Katika tafiti za vivo, inflammasome ya NLRP3 ilichangia kuondoa Leishmania, lakini haikuathiri tishu [54].Kinyume chake, katika tafiti za helminthiasis, uanzishaji wa inflammasome ya NLRP3 ulikandamiza kinga ya kinga ya mwenyeji dhidi ya helminthiasis ya utumbo [12].Shigella ni mojawapo ya bakteria kuu inayosababisha kuhara duniani kote.Bakteria hawa wanaweza kushawishi uzalishaji wa IL-1β kupitia P2X7 K+ efflux inayopatana na kipokezi, spishi tendaji za oksijeni, asidi ya lysosomal, na uharibifu wa mitochondrial.Inflammasome ya NLRP3 inadhibiti vibaya fagosaitosisi na shughuli ya baktericidal ya macrophages dhidi ya Shigela [55].Uchunguzi wa Plasmodium umeonyesha kuwa AIM2, NLRP3 au panya wenye upungufu wa caspase-1 walioambukizwa Plasmodium huzalisha viwango vya juu vya interferon ya aina ya 1 na ni sugu zaidi kwa maambukizi ya Plasmodium [56].Hata hivyo, jukumu la alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine katika kushawishi uanzishaji wa pathogenic wa kuvimba kwa NLRP3 katika panya haijulikani.
Katika utafiti huu, kizuizi cha NLRP3 inflammasome kwa MCC950 kilipunguza BW na kuongeza idadi ya trophozoiti katika maji ya lavage ya matumbo katika panya, na kusababisha mabadiliko makubwa zaidi ya pathological katika tishu za duodenal.Alpha-2 giardine na alpha-7.3 giardine huwasha panya mwenyeji NLRP3 inflammasome, kuongeza uzito wa mwili wa panya, kupunguza idadi ya trophozoiti katika maji ya lavage ya matumbo, na kupunguza vidonda vya pathological duodenal.Matokeo haya yanapendekeza kwamba G. duodenalis inaweza kuamilisha mwenyeji wa NLRP3 inflammasome kupitia alpha-2 giardine na alpha-7,3 giardine, na kupunguza pathogenicity ya G. duodenalis katika panya.
Kwa pamoja, matokeo yetu yanaonyesha kuwa alpha-2 na alpha-7.3 giardines hushawishi uanzishaji wa mwenyeji wa NLRP3 inflammasome na kupunguza uambukizaji wa G. duodenalis kwenye panya.Kwa hiyo, molekuli hizi ni malengo ya kuahidi kwa kuzuia giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: maelezo ya jumla.Hivi karibuni ilifunuliwa kuwa Pat Inflamm ni mzio wa madawa ya kulevya.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: mapitio ya pharmacotherapy.Maoni ya Mtaalam wa mfamasia.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, upinzani wa madawa ya kulevya na ugunduzi wa malengo mapya.Huambukiza malengo ya dawa za Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, nk. NLRP3 magonjwa ya uchochezi na ya uchochezi.Oksidi Med Kiini Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Jukumu la inflammasome katika kuvimba kwa matumbo na saratani.Gastroenterology.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Uanzishaji wa inflammasome wa kisheria na usio wa kawaida wa NLRP3 kwenye njia panda za uvumilivu wa kinga na kuvimba kwa matumbo.kabla ya kinga.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Uanzishaji wa inflammasome wa ROS-mediated NLRP3 unahusika katika kukabiliana na maambukizi ya N. caninum.Vekta ya vimelea.2020;13:449.